Аллергический метод исследования в микробиологии


Инфектология как наука и место в ней микробиологии. Микроскопические методы

АО «Медицинский университет Астана»

Кафедра: Микробиологии, вирусологии им. Ш. И. Сарбасовой

Тема: Инфектология как наука и место в ней микробиологии. Микроскопические методы.

Инфектология — наука, изучающая инфекционный процесс, инфекционную болезнь, инфекционную патологию, возникающую в результате конкурентного взаимодействия организма человека с патогенными или условно-патогенными микроорганизмами, и разрабатывающая методы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней.

Инфекционный процесс это комплекс взаимных приспособительных реакций на внедрение и размножение патогенного микроорганизма в макроорганизме, направленный на восстановление нарушенного гомеостаза и биологического равновесия с окружающей средой.
Современное определение инфекционного процесса включает взаимодействие трех основных факторов – возбудителя , макроорганизма и окружающей среды , каждый из которых может оказывать существенное влияние на его результат.

Патогенные микроорганизмы вызывают инфекционные заболевания у здоровых лиц. Патогенные микробы активно проникают в чувствительные организмы, так как паразитирование — важная часть их жизненного цикла.
Условно-патогенные микроорганизмы , как правило, лишены болезнетворных свойств и не вызывают инфекционных заболеваний у здорового человека. Условно-патогенные микробы вызывают поражения после пассивного переноса во внутреннюю среду организма . Важные условия их развития — массивность инфицирования и нарушения сопротивляемости организма .
Условно-патогенные и непатогенные (точнее, не способные вызывать поражения у здорового человека) микробы могут при определенных условиях вызывать оппортунистические (от англ.opportunity , возможность, удобный случай) инфекции. Подразделение микроорганизмов на непатогенные и условно-патогенные виды имеет нечеткие границы.
Некоторые микробы (например, условно-патогенные) способны размножаться в организме человека, не причиняя ему вреда. Это явление можно рассматривать как взаимную адаптацию микро- и макроорганизма. Такая форма паразитизма называется носительство .

Основные методы выявления микроорганизмов

1. Микроскопические методы включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер , так как многие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей.

2. Микробиологические методы позволяет точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале: включает культивирование, выделение чистой культуры и идентификацию микроорганизмов с учетом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, токсигенных и антигенных свойств.

3. Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение возбудителя, включают заражение лабораторных животных с последующим исследованием их.

4. Серологические методы выявления специфических антител и антигенов возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний.

5. Аллергологические методы . Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний (кожно-аллергические пробы).

Микроскопические методы исследования морфологии бактерий и грибов

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ
ДЛЯ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой. В некоторых случаях используют для этой цели препаровальные иглы.

Приготовление препарата для изучения микроорганизмов в нативном виде.
Метод «висячей капли». Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края.
Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат.
Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х.
После микроскопии препараты «раздавленной» капли или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

Приготовление фиксированных препаратов-мазков.
Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидком виде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.
Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 15-20 мин. в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт и другие фиксирующие жидкости.

Рис. 1. Фиксация прапарата-мазка пламенем.

МЕТОДЫ ОКРАСКИ МАЗКОВ

Простой метод . Фиксированный мазок окрасить каким-либо одним красителем, например фуксином водным (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промыть водой, высушить и микроскопировать.
Сложные методы . Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоты и др. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других. Окрас методом Грама является сложным методом.

Рис.2. Окрас методом Грама (схема).

  • На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.
  • Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.
  • Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.
  • Промыть водой.
  • Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет , грамотрицательные — в красный .

Краткий курс для иностранцев. Введение понятие о микробах. Методы исследования в микробиологии

Название Введение понятие о микробах. Методы исследования в микробиологии
Анкор Краткий курс для иностранцев.doc
Дата 01.12.2020
Размер 0,67 Mb.
Формат файла
Имя файла Краткий курс для иностранцев.doc
Тип Документы
#36875
страница 1 из 14
Каталог

ПОНЯТИЕ О МИКРОБАХ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В

Объектом изучения микробиологии являются микроорганизмы — мельчайшие невидимые не вооруженным глазом одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или растительного царства.

— малые размеры (обычно их измеряют в микрометрах — 10″ 6 м, мкм и нанометрах 10″ 9 — нм);

-слабая морфологическая дифференцировка (относительно простое строение);

-быстрый рост и размножение (в благоприятных условиях одна особь за сутки может дать потомство в сотни миллионов особей);

— высокая активность обменных процессов (быстрый синтез и разложение веществ, получение энергии);

-повсеместное распространение (связано с выраженной способностью к адаптации).

Микробиология является комплексом наук.

В зависимости от объекта исследования различают:

бактериологию, вирусологию, микологию (объект — грибы), протозоологию (объект — простейшие).

По целям изучения микробиология делится на:

общую, медицинскую, санитарную, ветеринарную, промышленную,

космическую и др.

Задачи медицинской микробиологии:

1. Изучение биологии патогенных (болезнетворных) и нормальных для человека микробов.

2. Изучение роли микробов в возникновении, развитии инфекционных (заразных) болезней и формировании иммунного ответа макроорганизма («хозяина»).

3. Разработка методов микробиологической диагностики, специфического лечения и профилактики инфекционных болезней человека.

Микробы, как наиболее древняя форма жизни, в системе организмов представлены довольно широко. Они входят (наряду с другими организмами) в домен эукариотов, полностью составляют домен прокариотов и царство вирусов.

Прокариоты — это, как правило, одноклеточные организмы, бактерии, отличающиеся слабой морфологической дифференцировкой (доядерные); для них характерно:

— отсутствие окруженногр мембраной ядра (носителем наследственности является нуклеоид замкнутая в кольцо нить ДНК, единственная «бактериальная хромосома»);

— отсутствие органелл (митохондрий, хлоропластов, комплекса Гольджи и др.);

— размножение бинарным делением;

— особое строение и состав клеточной стенки, малые размеры рибосом, своеобразные ферменты белкового синтеза.

Прокариоты разделены на 35 групп: спирохеты, несколько групп собственно бактерий (например, «грамположительные кокки», «спорообразующие грамположительные палочки и кокки», «грамотрицательные аэробные палочки и кокки» и др.), а также риккетсии и хламидии, микобактерии, микоплазмы. В основе деления прокариот на группы лежат: форма и строение клетки, отношение к окраске методом Грама, тип метаболизма и другие признаки. Внутри группы выделены более мелкие таксоны: порядок, семейство, род, вид (основной таксон). Название вида микроба состоит из названия рода и вида. Например, один из возбудителей дизентерии носит название- Shigella zonnei.

Эукариоты Микроскопические — это относительно более высоко организованные одноклеточные и многоклеточные организмы, имеющие сходство с клетками животных (простейшие) и растений (грибы).

Для эукариот характерны:

— наличие истинного ядра, в котором находится набор линейных хромосом, распределяющихся в ходе митоза в дочерние клетки;

— различные органеллы (митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулюм и др.);

— рибосомы большего размера, чем у прокариот;

-способность к эндоцитозу (захвату частиц и растворенных веществ).

Вирусы — это мельчайшие неклеточные организмы, которые можно противопоставить всем другим существам. Основные свойства вирусов:

отсутствие клеточного строения;

— отсутствие собственных метаболических систем (у вирусных частиц — вирионов нет обмена с внешней средой);

— облигатный внутриклеточный паразитизм;

— разобщенный способ размножения;

— наследственный материал (геном) представлен одним типом нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Методы исследования в микробиологии Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический,’ экспериментальный, иммунологический, молекулярно-генетический.

1. Микроскопический — изучение морфологии микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический — (бактериологический, культурный) -посев материала на питательные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одного вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из конкретного источника в определенное время, (например, штамм №8 Shigella flexneri, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения одной клетки (используется при изучении микробных популяций, в генетических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами. В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы антитела (AT), способные вступать с данным антигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан на выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа свидетельствует о предшествующей встрече с ним микробом: возможно, человек переболел соответствующей инфекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Чисто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентификация по антигенной структуре).

5. Молекулярно-генетический метод — использование моноклональных антител, и современных методов диагностики основанных на обнаружении нуклеиновой кислоты возбудителя (ДНК или РНК), рецепторов клеток и т.д.
МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ.

1Световой микроскоп с иммерсионной системой

Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз, поэтому используются микроскопы с иммерсионной системой («иммерсио» — погружение). Иммерсионная система включает: иммерсионный объектив (х 90 ) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива. Поскольку показатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива. При микроскопии необходимо помнить, что объективы «сухой системы» не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность. Микроскопия с иммерсионной сиетемой позволяет изучать убитые микробы в окрашенном к (стоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клетки) и дифференцировать одни микробы от других. Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами. В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно крупных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым нолем зрения (объективы х 40 или х 8 ) Для микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля». Измерение микробов.Изучение морфологических признаков микробов (длина, ширина, форма) нередко проводят для определения их вида. Размеры клеточных микроорганизмов варьируют от долей микрометра (мкм, 10 -6 м) до нескольких десятков микрометров. Мелкие клетки бактерий имеют размеры 1-2, крупные от 8 до 12 мкм и более. Для измерений используют окуляр-микрометр (встроенную в окуляр прозрачную линейку) и объект микрометр.

2Темнопольный микроскоп (ультрамикроскоп)

Особенностью этого микроскопа является наличие конденсора темного поля (параболоид-конденсора), который концентрирует световой пучок и направляет его на исследуемый объект сбоку. Ввиду того, что прямые лучи отсекаются центральной диафрагмой конденсора, а косые лучи, выходящие по периферии диафрагмы, не попадают в объектив, ультрамикроскоп еет темное поле зрения. При освещении косыми лучами живых и неживых частиц, в т.ч. микробов, часть отраженных лучей попадает в объектив; при этом наблюдается яркое свечение частиц на темном фоне. Темнопольную микроскопию используют для изучения подвижности микробов, наблюдения очень тонких объектов (спирохет) в препарате «раздавленная капля».

Эта разновидность светового микроскопа позволяет изучать структуру живых неокрашенных микробов (прозрачных объектов). При прохождении света через неокрашенные микробные клетки, в отличии от окрашенных, амплитуда снеговых волн не меняется, а происходит лишь их изменение по фазе, что не улавливается глазом человека. Сдвиг по фазе происходит при прохождении участков с большей оптической плотностью (рибосомы, нуклеоид). Специальные

приспособления: фазовый конденсор и объективы с фазовыми кольцами позволяют преобразовать невидимые фазовые изменения в видимые амплитудные.

Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра светятся цветами с большей длиной волны (зеленым, оранжевым и др.). В люминесцентном микроскопе изучают как живые, так и убитые микробы (с «сухой» или иммерсионной системами). Люминесцентная микроскопия позволяет получить контрастное цветное изображение, обнаружить малое количество микробов, изучить их структуру и химический состав, использовать метод иммунофлюоресценции.

Этот прибор отличается от световых микроскопов значительно большей разрешающей способностью (около 0,001 мкм) за счет использования вместо света пучка электронов, а вместо стеклянных оптических — электромагнитных линз. В электронном микроскопе изучают вирусы, ультраструктуру убитыхх микроорганизмов. Приготовление препарата для микроскопического

I — приготовление мазка.

Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.


Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.

Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон,

смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.

Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристалл-виолетом (3-5 минут), а сложных • окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.

Дифференцирующий метод Грама.

После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+), другие — в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.

Гр+ бактерии кокки

палочки (спорообразующие): бациллы, клостридии; палочки (неспорообразующие): коринебактерии, микобактерии, актиномицеты

Гр- бактерии кокки

нейссерии, вейллонеллы; палочки (неспорообразующие): энтеробактерии, вибрионы; извитые: спириллы, спирохеты кампилобактерии.

После высушивания мазки готовы для микроскопии.
Основные формы бактерий

Структура бактериальной клетки. Обязательные (постоянные) структурные элементы

Обязательными структурными элементами бактерий являются: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка.

Цитоплазма прокариотов в отличие от эукариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в клетке бактерий функцию ядра, т.е. является носителем генетической информации, однако, в отличие от ядра эукариотическоЙ клетки, он не имеет ядерной мембраны, не делится митозом. Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида является единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму и состоит яз тонкого слоя фосфолипидов и белка. Функции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта веществ, участие в биосинтезе веществ, делении клетки. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии.

Клеточная стенка у Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидогликан, который придает клеточной стенке прочность.

Клеточная стенка определяет форму бактерий, служит для механической защиты, участвует в питании за счет диффузии и осмоса. У Гр- бактерий клеточная стенка представлена тонким слоем пептидогликана, покрытого наружной мембраной, в состав которой входят белки, фосфолипиды и липополисахариды (ЛПС). Наружная мембрана клеточной стенки патогенных микробов во многом определяет специфичность их взаимодействия с организмом хозяина и помогает в распознавании близкородственных микробов. По компонентам и структуре клеточной стенки, биохимическим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Поэтому лекарственные препараты, специфически воздействующие, например, на бактериальные стенки, безвредны для высших организмов. Клеточную стенку бактерий выявляют при электронной микроскопии, специальным окрашиванием или в опыте плазмолиза.

Микроскопические методы исследования в микробиологии

Микроскопические методы исследования представляют собой способы изучения разнообразных объектов с использованием специального оборудования. Оно позволяет рассматривать строение веществ и организмов, величина которых находится за границами разрешающей способности человеческого взгляда. В статье проведем краткий анализ микроскопических методов исследования.

Общие сведения

Современные методы микроскопического исследования используют в своей практике разные специалисты. Среди них вирусологи, цитологи, гематологи, морфологи и прочие. Основные методы микроскопического исследования известны достаточно давно. В первую очередь это световой способ рассмотрения объектов. В течение последних лет активно вводятся в практику и другие технологии. Так, популярность приобрели фазово-контрастный, люминесцентный, интерференционный, поляризационный, инфракрасный, ультрафиолетовый, стереоскопический метод исследования . Все они базируются на разнообразных свойствах света. Кроме этого, широко используются электронно-микроскопические методы исследования . Эти способы позволяют отобразить объекты с помощью направленного потока заряженных частиц. Стоит отметить, что такие приемы изучения применяются не только в биологии и медицине. Достаточно популярен микроскопический метод исследования металлов и сплавов в промышленности. Такое изучение позволяет оценивать поведение соединений, вырабатывать технологии для минимизации вероятности разрушения и усиления прочности.

Световые способы: характеристика

Такие микроскопические методы исследования микроорганизмов и других объектов базируются на различной разрешающей способности оборудования. Немаловажными факторами при этом является направленность луча, особенности самого объекта. Последний, в частности, может быть прозрачным или непрозрачным. В соответствии со свойствами объекта, меняются физические свойства светового потока – яркость и цвет, обусловленные амплитудой и длиной волны, плоскость, фаза и направленность распространения волны. На использовании этих характеристик и строятся разные микроскопические методы исследования .

Специфика

Для изучения световыми способами объекты, как правило, окрашивают. Это позволяет выявить и описать те или иные их свойства. При этом необходимо, чтобы ткани были фиксированными, поскольку окраска выявит определенные структуры исключительно в убитых клетках. В живых элементах краситель обосабливается в виде вакуоли в цитоплазме. Она не прокрашивает структуры. Но с помощью светового микроскопа можно исследовать и живые объекты. Для этого используется витальный способ изучения. В таких случаях применяется темнопольный конденсор. Он встраивается в световой микроскоп.

Изучение неокрашенных объектов

Оно осуществляется с помощью фазово-контрастной микроскопии. Этот способ базируется на дифракции луча в соответствии с особенностями объекта. В процессе воздействия отмечается изменение фазы и длины волны. В объективе микроскопа присутствует полупрозрачная пластинка. Живые или фиксированные, но не окрашенные объекты из-за своей прозрачности почти не изменяют цвет и амплитуду луча, проходящего сквозь них, провоцируя только сдвиг волновой фазы. Но при этом, пройдя через объект, световой поток отклоняется от пластинки. В итоге между лучами, пропущенными сквозь объект, и входящими в световой фон, появляется разность волновой длины. При определенном ее значении возникает визуальный эффект – темный объект будет четко виден на светлом фоне либо наоборот (в соответствии с особенностями фазовой пластинки). Для его получения разность должна составлять не меньше 1/4 длины волны.

Аноптральный способ

Он является разновидностью фазово-контрастного метода. Аноптральный способ предполагает использование объектива со специальными пластинками, которые меняют только цвет и яркость фонового света. Это существенно расширяет возможности изучения неокрашенных живых объектов. Применяется фазово-контрастный микроскопический метод исследования в микробиологии , паразитологии при изучении растительных и животных клеток, простейших организмов. В гематологии этот способ используется для расчета и определения дифференцировки элементов крови и костного мозга.

Интерференционные приемы

Эти микроскопические методы исследования решают в целом те же задачи, что и фазово-контрастные. Однако в последнем случае специалисты могут наблюдать только контуры объектов. Интерференционные микроскопические методы исследования позволяют изучать их части, выполнять количественную оценку элементов. Это возможно благодаря раздвоению светового луча. Один поток проходит сквозь частицу объекта, а другой – мимо. В окуляре микроскопа они сходятся и интерферируют. Возникающая разность фаз может определяться по массе разных клеточных структур. При последовательном ее измерении с заданными показателями преломления можно установить толщину нефиксированных тканей и живых объектов, содержание белков в них, концентрацию сухого вещества и воды и пр. В соответствии с полученными данными специалисты получают возможность косвенно оценивать проницаемость мембран, активность ферментов, клеточный метаболизм.

Поляризация

Она осуществляется с помощью призм Николя или пленчатых поляроидов. Их помещают между препаратом и источником света. Поляризационный микроскопический метод исследования в микробиологии позволяет изучать объекты с неоднородными свойствами. В изотропных структурах быстрота распространения света не зависит от выбранной плоскости. При этом в анизотропных системах скорость изменяется в соответствии с направленностью света по поперечной либо продольной оси объекта. В случае если величина преломления вдоль структуры будет больше, чем вдоль поперечной, создается двойное положительное лучепреломление. Это свойственно многим биологическим объектам, у которых обнаруживается строгая молекулярная ориентация. Они все являются анизотропными. К этой категории, в частности, относятся миофибриллы, нейрофибриллы, реснички в мерцательном эпителии, коллагеновые волокна и прочие.

Значение поляризации

Сравнение характера лучевого преломления и показателя анизотропии объекта дает возможность оценивать молекулярную организацию структуры. Поляризационный метод выступает как один из гистологических способов анализа, используется в цитологии и пр. В свете можно изучать не только окрашенные объекты. Поляризационный метод дает возможность исследовать неокрашенные и нефиксированные – нативные – препараты тканевых срезов.

Люминесцентные приемы

Они базируются на свойствах некоторых объектов давать свечение в сине-фиолетовом участке спектра или в УФ-лучах. Многие вещества, например белки, некоторые витамины, коферменты, лекарственные средства, наделены первичной (собственной) люминесценцией. Другие объекты начинают светиться при добавлении флюорохромов – специальных красителей. Эти добавки избирательно или диффузно распространяются на отдельные клеточные структуры или химические соединения. Это свойство легло в основу использования люминесцентной микроскопии при гистохимических и цитологических исследованиях.

Области использования

Применяя иммуно-флуоресценцию, специалисты обнаруживают вирусные антигены и устанавливают их концентрацию, идентифицируют вирусы, анти тела и антигены, гормоны, разнообразные продукты метаболизма и так далее. В этой связи при диагностике герпеса, эпидемического паротита, вирусного гепатита, гриппа и прочих инфекций используются люминесцентные методы исследования материалов. Микроскопический иммуно-флуоресцентный способ позволяет распознавать опухоли злокачественного характера, определять ишемические участки в сердце на ранних этапах инфаркта и пр.

Использование ультрафиолета

Оно основывается на способности ряда веществ, включенных в живые клетки, микроорганизмы или фиксированные, но неокрашенные, прозрачные при видимом свете ткани поглощать УФ-лучи определенной длины волн. Это характерно, в частности, для высокомолекулярных соединений. К ним относят белки, ароматические кислоты (метилаланин, триптофан, тирозин и пр.), нуклеиновые кислоты, пирамидиновые и пуриновые основания и так далее. Ультрафиолетовая микроскопия позволяет уточнить локализацию и количество этих соединений. При изучении живых объектов специалисты могут наблюдать изменения процессов их жизнедеятельности.

Дополнительно

Инфракрасная микроскопия используется при исследовании непрозрачных для света и УФ-лучей объектов посредством поглощения их структурами потока, длина волны которого 750-1200 нм. Чтобы применить этот способ нет необходимости предварительно подвергать препараты химической обработке. Как правило, инфракрасный метод используется в антропологии, зоологии и прочих биологических отраслях. Что касается медицины, то этот способ применяют преимущественно в офтальмологии и нейроморфологии. Изучение объемных объектов осуществляется с помощью стереоскопической микроскопии. Конструкция оборудования позволяет выполнять наблюдение левым и правым глазом под различным углом. Непрозрачные объекты исследуются при сравнительно небольшом увеличении (не более 120 раз). Стереоскопические способы используются в микрохирургии, патоморфологии, в судебной медицине.

Электронная микроскопия

Она используется для изучения структуры клеток и тканей на макромолекулярном и субклеточном уровнях. Электронная микроскопия позволила сделать качественный скачок в сфере исследований. Этот способ широко применяется в биохимии, онкологии, вирусологии, морфологии, иммунологии, генетике и прочих отраслях. Значительное усиление разрешающей способности оборудования обеспечивается потоком электронов, которые проходят в вакууме сквозь электромагнитные поля. Последние, в свою очередь, создаются специальными линзами. Электроны обладают способностью проходить сквозь структуры объекта либо отражаться от них с отклонениями под разными углами. В результате создается отображение на люминесцентном экране прибора. При просвечивающей микроскопии получается плоскостное изображение, при сканирующей, соответственно, объемное.

Необходимые условия

Стоит отметить, что перед тем, как пройти электронное микроскопическое исследование, объект подвергается специальной подготовке. В частности, используется физическая либо химическая фиксация тканей и организмов. Секционный и биопсийный материал, кроме этого, обезвоживают, внедряют в эпоксидные смолы, разрезают алмазными или стеклянными ножами на ультратонкие срезы. Затем их контрастируют и изучают. В сканирующем микроскопе исследуются поверхности объектов. Для этого на них напыляют специальные вещества в вакуумной камере.

Тема №2. Микроскопический метод исследования микроорганизмов.

Микробиология. Лабораторный практикум

Волгоград 2012

Введение

Микробиология(от греч. micros — малый, bios — жизнь, logos — учение) — наука, изучающая строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов мельчайших форм жизни растительного или животного происхождения, не видимых невооруженным глазом.

Микробиология изучает всех представителей микромира (бактерии, грибы). По своей сути микробиология является биологической фундаментальной наукой. Для изучения микроорганизмов она использует методы других наук, прежде всего физики, биологии, биоорганической химии, молекулярной биологии, генетики, цитологии, иммунологии. Как и всякая наука, микробиология подразделяется на общую и частную. Общая микробиология изучает закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на всех уровнях: молекулярном, клеточном, популяционном; генетику и взаимоотношения их с окружающей средой. Предметом изучения частной микробиологии являются отдельные представители микромира в зависимости от проявления и влияния их на окружающую среду, живую природу, в том числе человека. К частным разделам микробиологии относятся: медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел биотехнологии), морская, космическая микробиология.

Медицинская микробиология изучает патогенные для человека микроорганизмы: бактерии, вирусы, грибы, простейшие. В зависимости от природы изучаемых патогенных микроорганизмов медицинская микробиология делится на бактериологию, вирусологию, микологию, протозоологию.

Каждая из этих дисциплин рассматривает следующие вопросы:

морфологию и физиологию, т.е. осуществляет микроскопические и другие виды исследований, изучает обмен веществ, питание, дыхание, условия роста и размножения, генетические особенности патогенных микроорганизмов;

роль микроорганизмов в этиологии и патогенезе инфекционных болезней;

основные клинические проявления и распространенность вызываемых заболеваний;

специфическую диагностику, профилактику и лечение инфекционных болезней;

экологию патогенных микроорганизмов.

К разделам микробиологии относят также санитарную и клиническую микробиологию.

Санитарная микробиология изучает микрофлору окружающей среды, взаимоотношение микрофлоры с организмом, влияние микрофлоры и продуктов ее жизнедеятельности на состояние здоровья человека, разрабатывает мероприятия, предупреждающие неблагоприятное воздействие микроорганизмов на человека. В центре внимания клинической микробиологии. Роль условно-патогенных микроорганизмов в возникновении заболеваний человека, диагностика и профилактика этих болезней.

Фармацевтическая микробиология исследует инфекционные болезни лекарственных растений, порчу лекарственных растений и сырья под действием микроорганизмов, обсемененность лекарственных средств в процессе приготовления, а также готовых лекарственных форм, методы асептики и антисептики, дезинфекции при производстве лекарственных препаратов, технологию получения микробиологических и иммунологических диагностических, профилактических и лечебных препаратов.

Ветеринарная микробиология изучает те же вопросы, что и медицинская микробиология, но применительно к микроорганизмам, вызывающим болезни животных.

Микрофлора почвы, растительного мира, влияние ее на плодородие, состав почвы, инфекционные заболевания растений и т.д. находятся в центре внимания сельскохозяйственной микробиологии.

Морская и космическая микробиология изучает соответственно микрофлору морей и водоемов и космического пространства и других планет.

Техническая микробиология, являющаяся частью биотехнологии, разрабатывает технологию получения из микроорганизмов разнообразных продуктов для народного хозяйства и медицины (антибиотики, вакцины, ферменты, белки, витамины). Основа современной биотехнологии — генетическая инженерия.

Многочисленные открытия в области микробиологии, изучение взаимоотношений между макро- и микроорганизмами во второй половине XIX в. способствовали началу бурного развития иммунологии. Вначале иммунология рассматривалась как наука о невосприимчивости организма к инфекционным болезням. В настоящее время она стала общемедицинской и общебиологической наукой. Доказано, что иммунная система служит для защиты организма не только от микробных агентов, но и от любых генетически чужеродных организму веществ с целью сохранения постоянства внутренней среды организма, т.е. гомеостаза.

Иммунологияявляется основой для разработки лабораторных методов диагностики, профилактики и лечения инфекционных и многих неинфекционных болезней, а также разработки иммунобиологических препаратов (вакцин, иммуноглобулинов, иммуномодуляторов, аллергенов, диагностических препаратов). Разработкой и производством иммунобиологических препаратов занимается иммунобиотехнология самостоятельный раздел иммунологии.

Современная медицинская микробиология и иммунология достигли больших успехов и играют огромную роль в диагностике, профилактике и лечении инфекционных и многих неинфекционных болезней, связанных с нарушением иммунной системы (онкологические, аутоиммунные болезни, трансплантация органов и тканей и др.).

Тема №1. «Микробиологическая лаборатория, ее задачи. Техника безопасности работы в лаборатории. Оборудование, устройство светового микроскопа и техника микрокопирования. Основные формы бактерий, определение их величины»

Цель занятия: Изучить микробиологическую лабораторию. Технику безопасности работы в лаборатории. Оборудование, устройство светового микроскопа.

Материалы и оборудование:

Ветеринарные лаборатории – это учреждения государственной ветеринарной службы, деятельность которых направлена на обеспечение благополучия в животноводстве, предупреждение и ликвидацию болезней и гибели животных, а также на охрану населения от болезней, общих для человека и животных (зооантропонозов). По значению бывают: районные, межрайонные (зональные), областные (краевые) и республиканские.

Основная задача ветеринарных лабораторий – установление точного диагноза болезней сельскохозяйственных животных, включая птиц, пушных зверей, рыб и пчел, а также экспертизы мяса, молока и других пищевых продуктов животного и растительного происхождения. Также выполняются научно – исследовательские работы, осуществляют производство некоторых антибиотиков, биостимуляторов.

Лаборатория занимает отдельное здание, расположенное вдали от проезжих дорог. В ней должно быть приемное отделение, патологоанатомический, биохимический и вирусологический отделы, спец помещения для термостатов, мытья посуды, автоклавная.

В лаборатории столы для работы расположены у окна так, чтобы было максимум света и удобств. При небольшом количестве окон в лаборатории для занятий можно использовать столы трапециевидной формы, такие столы ставят перпендикулярно к окну, края столов должны быть скошены под углом 70-80°, это позволяет сидящим дальше от окна беспрепятственно пользоваться светом.

Столы покрываются пластиком, толстым стеклом. Вдоль стола, посередине ставят штативы для пробирок, флаконы, капельницы с красителями в штативах, колодках, спиртовки или горелки. По этому же ряду монтируют освещение, которое должно быть приближено к естественному. Для занятий по проведению биологических исследований, вскрытию органов желательно иметь дополнительный небольшой стол. Для полного обеспечения учебного процесса в лаборатории должны быть культуры микроорганизмов, аппаратура и подсобные помещения:

Должны иметься столы, раковины, электрические и газовые плиты, сушильные и вытяжные шкафы, которые необходимы для удаления паров воды и некоторых реактивов, используемых при мойке стекол и посуды. Пол и стены должны быть облицованы плиткой.

Оборудована 1 или 2 стерилизаторами паровых, столом, при наличии 2-х паровых стерилизаторов занятия в нескольких подгруппах можно проводить без длительного перерыва, а во время повреждения одного из них, пользуются другим.


Здесь должна быть хорошая вентиляция для удаления остатка пара, выходящего после открывания стерилизатора. Пар из стерилизатора выводят через резиновую трубку во внешнюю среду или направляют в ведро с водой. Дверь неостекленная, окна открываются наружу.

Необходима для приготовления питательных сред. Стены должны быть покрыты плиткой или покрашены масляной краской. Пол выложен плиткой или настелен линолеум. Здесь необходимы электрические или газовые плита, ящик с отсеками для сред в пробирках, столы, шкафы для хранения компонентов сред, мясные среды, холодильник.

Могут быть термостаты разных форм и размеров для выращивания плесневых грибов; температура должна быть 20-25°С, для большинства сапрофитов 25-30°С, для возбудителей инфекционных болезней температура 35-37°С.

Место для работы обслуживающего персонала и подготовки оснащения к лабораторно-практическим занятиям. Здесь располагается всё необходимое для проведения учебного процесса, а также дистиллятор, весы, центрифуга и т.д.

Предназначена для посева и пересева культур микроорганизмов и проведения научно-исследовательской работы, которая требует стерильных условий. Комната должна иметь предбоксник (тамбур) с раздвижной дверью, остекленной; стекла должны быть хорошо промазаны, чтобы не проникал воздух из окружающей среды и микроорганизмы.

Стены обложены плиткой или выкрашены масляной краской, на полу линолеум.

Моют бокс влажным способом с применением дезинфицирующих средств: 2-3% раствором соды (Na2HCO3), гидрокарбонатом натрия (NaHCO3) или 3-5% раствор фенола. Воздух стерилизуется бактерицидной лампой (БУВ-15), которая излучает ультрафиолетовые лучи. Стерилизация проводится от 30 мин до нескольких часов. Нахождение в комнате с включенной бактерицидной лампой нежелательно, т.к. УФ лучи вызывают острое воспаление роговицы глаза.

Это помещение, где содержат белых мышей, крыс, морских свинок и т.д. Их используют в научно-исследовательских работах, реже на занятиях, поэтому, где нет условий, вивария нет. Реактивы и некоторые биопрепараты хранят в подвальных помещениях или темном стенном шкафу, где сухо, невысокая температура и нет резких колебаний в течение года.

Материалом для лабораторных исследований служат: кровь, моча, кал, мокрота, молоко, фекалии, содержимое абсцессов (гной), полученные при жизни животного, кусочки паренхиматозных органов или других тканей после их гибели, пробы объектов окружающей среды. Материал исследуют бактериологическими, серологическими, гистологическими, биохимическими, микологическими и токсикологическими методами, для чего должны быть созданы необходимые условия (оборудование, специально отведенные помещения)

В лаборатории выделено специальное место для окраски микроскопических препаратов, где находятся растворы специальных красителей, спирт, кислоты, фильтровальная бумага и др. Каждое рабочее место снабжено газовой горелкой или спиртовкой, банкой с дезинфицирующим раствором. Для повседневной работы лаборатория должна располагать необходимыми питательными средами, химическими реактивами, диагностическими препаратами и другими лабораторными материалами. В крупных лабораториях имеются термостатные комнаты для массового выращивания микроорганизмов, постановки серологических реакций.

Для выращивания, хранения культур, стерилизации лабораторной посуды и других целей предназначена следующая аппаратура:

Термостат. Аппарат, в котором поддерживается постоянная температура. Оптимальная температура для размножения многих микроорганизмов составляет 37°С. Термостаты бывают воздушными и водяными.

Микроанаэростат. Аппарат для выращивания микроорганизмов в анаэробных условиях.

Холодильники. Используют в микробиологических лабораториях для хранения культур микроорганизмов, питательных сред, крови, сывороток, вакцин и прочих биологических препаратов при температуре около 4°С. Для хранения препаратов ниже 0°С предназначены низкотемпературные холодильники, в которых поддерживается температура —20 °С и ниже.

Центрифуги. Применяют для осаждения микроорганизмов, эритроцитов и других клеток, разделения неоднородных жидкостей (эмульсии, суспензии). В лабораториях используют центрифуги с различными режимами работы.

Сушильно-стерилизационный шкаф (печь Пастера). Предназначен для воздушной стерилизации лабораторной посуды и других материалов.

Стерилизатор паровой (автоклав). Предназначен для стерилизации паром под давлением. В микробиологических лабораториях используются автоклавы разных моделей (вертикальные, горизонтальные, стационарные, переносные).

Для уничтожения микроорганизмов в воздухе и на поверхностях существуют различные способы дезинфекции.

Воздух в лаборатории частично очищают проветриванием. Вентиляция резко снижает численность микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице температур снаружи и внутри помещения. Продолжительность проветривания не менее 30. 60 мин.

Более эффективный способ обеззараживания воздуха — воздействие ультрафиолетовым излучением (УФИ), обладающим высоким антимикробным действием и вызывающим гибель не только вегетативных клеток, но и спор микроорганизмов. Стерилизация 30 мин до нескольких часов в зависимости от степени загрязненности воздуха.

Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории протирают растворами различных дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего используют 0,5. 3%-й водный раствор хлорамина. Особенно тщательно следует дезинфицировать поверхность стола, на котором проводится работа с микроорганизмами. Ее необходимо протирать дезинфицирующим раствором как перед началом работы, так и после окончания.

Правила и техника безопасности при работе в лаборатории.

· Заходить и работать в микробиологической лаборатории только в халате, чепчике, бахилах.

· Не вносить в лабораторию посторонних вещей

· Работать на одном и том же месте и пользоваться закрепленным оборудованием

· Соблюдать чистоту и опрятность

· Во избежание заражения во время перерыва в работе не курить и не есть

· Работая с каким-либо материалом работать как с особо опасным предметом

· По окончании занятий рабочее место и оборудование приводить в порядок

· Во избежание взрыва не зажигают одну спиртовку от другой

· Не прикасаются металлическими предметами к проводам и контактными частями электросети

· Без разрешения преподавателя или обслуживающего персонала не включать оборудование

· Соблюдать правила обращения с химическими и другими реактивами

· Уходя, вымыть руки материал, используемый на учебных занятиях, принимают за особо опасный;

· При распаковке материала, присланного для исследования, необходимо соблюдать осторожность: банки снаружи обтирают дезинфицирующим раствором и ставят только на подносы или кюветы;

· При исследовании поступившего материала и при работе с бактериальными культурами соблюдают общепринятые в бактериологической практике технические приемы, исключающие возможность инфицирования работника;

Тема №2. Микроскопический метод исследования микроорганизмов.

Цель занятия: научиться пользоваться микроскопом, изучить морфологию микроорганизмов.

Материалы: микроскоп, колбы, чашки Петри, штативы с пробирками, иммерсионное масло, предметные и покровные стекла

При выполнении любых микробиологических исследований необходимо точно знать особенности строения микроорганизмов. Эти сведения могут быть получены только путем изучения данного организма с помощью микроскопа. Первый простейшего устройства оптический микроскоп был сконструирован Антони ван Левенгуком (рис. 1).

В настоящее время многие вопросы цитологии микробов решаются на уровне электронной микроскопии. Микробиологические лаборатории оснащены микроскопами различных моделей: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др. Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинкториальные (способность окрашиваться теми или иными красителями) свойства, подвижность, наличие специальных структурных элементов (спора, капсула).

Современный микроскоп состоит из оптической и механической частей. К механической части относятся штатив, тубус (труба) с револьверным устройством, предметный столик, механизм тонкой и грубой наводки (рис. 1).Штатив состоит из двух частей: держателя трубы микроскопа и массивной которая служит опорой микроскопа.

Рис. 1. Устройство оптического микроскопа:

1— основание микроскопа; 2 — рукоятка макрометрического винта; 3 — тубусодержатель; 4—тубус; 5—окуляр; 6— револьвер объективов; 7—объектив; 8—предметный столик; 9—конденсор; 10— осветитель; 11 — рукоятка микрометрического винта

На штативе укреплен подвижный столик, который приводится в движение двумя винтами, расположенными по его бокам. При помощи этих винтов препарат вместе со столиком вращается и перемещается в разных направлениях, что облегчает его рассмотрение.

В тубусе находится оптическая система. Он перемещается вверх и вниз при помощи двух винтов. Для более грубого перемещения служит зубчатка, или кремальера. Точная установка достигается движением микровинта с мелкой нарезкой: полный оборот микровинта передвигает тубус на 0,1 мм.

В нижней части тубуса имеется револьверное устройство, в которое можно ввинчивать 4 объектива (на некоторых микроскопах 5) и переключать их во время работы. В верхнее отверстие тубуса вставляется окуляр.

Оптическая часть микроскопа состоит из окуляров, объективов, конденсора и зеркала.

Зеркало отражает падающий на него свет и направляет его в конденсор для освещения препарата. Одна сторона зеркала плоская; ею пользуются при любом источнике света и при любом увеличении. Другая, вогнутая, сторона зеркала предназначена для работы без конденсора при малых увеличениях.

Конденсор состоит из нескольких линз, собирающих отраженный зеркалом свет в пучок и направляющих его па плоскость препарата. В нижней части конденсора расположена ирисовая диафрагма, посредством которой можно менять угол лучей и количество пропускаемого конденсором света. Фокусировку конденсора осуществляют специальным микровинтом.

Наиболее важная часть микроскопа — объектив. Он представляет собой систему линз, строящих действительное, увеличенное и перевернутое изображение объекта. Используют 2 типа объективов: погруженный (иммерсионный), сухой. Иммерсионный объектив дает наибольшее увеличение. Используют кедровое масло.

Окуляр микроскопа — это увеличивающая оптическая система, через которую рассматривается действительное изображение объекта, которое дает объектив. Окуляр состоит из двух линз: собирающей, обращенной к объективу, и глазной, обращенной к глазу. Между ними находится диафрагма, которая задерживает боковые лучи и пропускает лучи, близкие к оптической оси и дающие более контрастное изображение. Окуляр еще раз увеличивает построенное объективом изображение объекта, но не раскрывает новых деталей его строения.

Классификация (таксономия) микроорганизмов. Вначале в основу классификации микроорганизмов были положены морфологические признаки, так как больше о них человек ничего не знал. В 1896 г. К. Леман и Р. Нейман предприняли попытки объединить микроорганизмы в три группы: шаровидные (Соссасеае), палочковидные (Bacteriaceae) и извитые (Spirillaceae). В 1897 г. для систематики микробов стали использовать наряду с морфологическими и физиологические признаки. Как выяснилось впоследствии, для научно обоснованной классификации одних каких-нибудь признаков бывает недостаточно. Поэтому в настоящее время используют комплекс признаков: фенотипические (морфологические, культуральные, физиологические и другие свойства), а также генотипические (физико-химические свойства ДНК).

Для обозначения микроорганизмов принята двойная (бинарная) номенклатура, которая включает в себя названия рода и вида. Родовое название пишется с прописной буквы, видовое, даже происходящее от фамилии, — со строчной. Например, бациллу сибирской язвы называют Bacillus anthracis, кишечную палочку — Esherichia coli, возбудителя эмфизематозного карбункула — Clostridium chauvoei и т. д.

Основной (низшей) таксономической единицей является вид. Виды — в роды, роды — в семейства, семейства — в порядки, порядки — в классы, классы — в отделы, отделы — в царства.

Вид — это совокупность популяций, имеющих общее происхождение и генотип, морфологические, физиологические и другие признаки, способные в определенных условиях вызывать одинаковые процессы.

Культура — микроорганизмы, полученные от животного, чело­века, растения или субстрата внешней среды и выращенные на питательной среде. Чистые культуры состоят из особей одного вида, смешанные представляют собой скопления клеток разных видов. Микробиологи часто употребляют слово «штамм».

Штамм — это культура -одного и того же вида, выделенная из разных сред и отличающаяся незначительными изменениями свойств (неодинаковая биохимическая активность, чувствитель­ность к лекарственным веществам и т. д.). Например, кишечная палочка, выделенная от крупного рогатого скота, и такая же палочка, выделенная от свиней, могут быть разными штаммами.

Клон — культура микроорганизмов, выделенная из одной клетки.

В названиях микробов, различающихся по некоторым свойствам, вместо суф- фикса «тип» введен суффикс «вар». Так, биотип называют биовар, серотип — серовар, фаготип — фаговар и т. д.

Форма и строение микробов. Микробы — одноклеточные бесхлорофилльные организмы прокариотического типа. По форме отмечают палочковидные, извитые микробы. Основными формами имеются переходные (коккобактерии и др.).

Шаровидные (кокковые Соссасеае) микробы по форме напоминают шар, но бывают овальные, плоские, односторонне вогнутые или слегка вытянутые.Характеризуются отсутствием подвижности и способности к спорообразованию, однако некоторые бактерии способны образовывать цисты. Шаровидные формы образуются в результате деления клеток в одной, двух, трех взаимно перпендикулярных или разных плоскостях. При делении клеток в одной плоскости клетки могут располагаться попарно, в связи, с чем такие формы получили название диплококков. Если деление происходит последовательно в одной плоскости и клетки соединены в виде цепочки — это стрептококки. Деление кокка в двух взаимно перпендикулярных плоскостях ведет к образованию четырех клеток, или тетракокка. Пакетообразные кокки, или сарцины, — результат деления кокков в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Беспорядочное расположение клеток или образование скоплений, напоминающих гроздья винограда, происходит при делении кокков в разных плоскостях; такие формы называются стафилококками.

Рис. 2. Основные формы микроорганизмов (схема): шаровидные: 1— стафилококки, 2 — диплококки, 3 — стрептококки, 4 — тетракокки, 5— сарцины; палочковидные: 6—бактерии, 7—стрептобакте-рии, 8— бациллы, 9— стрептобациллы; извитые: 10— вибрионы, 11 — спи­риллы, 12 — спирохеты

Палочковидные, или цилиндрические (Bacteriaceae) формы принято делить на бактерии, бациллы и клостридии. Вытянутой формы, концы могут быть ровными, заостренными, закругленными. Имеются подвижные и неподвижные представители. Движение зависит от видовой принадлежности, возраста культуры и условий выращивания. Подвижные формы передвигаются с помощью жгутиков. Некоторые бактерии могут образовывать споры, которые служат для переживания неблагоприятных внешних условий, отличаются высокой устойчивостью к колебаниям температуры, высушиванию, воздействию химических веществ. Они имеют утолщенную стенку, низкое содержание воды, замедленные метаболические процессы. После формирования споры оболочка и содержимое материнской клетки разрушается. Попадая в благоприятные условия спора, превращается в вегетативную клетку. Бактерии — палочковидные формы, не образующие спор (пишут Bact., например Bact. aceti). Бациллы (аэробы)— палочковидные формы, образующие споры (пишут Вас. например Вас. subtilis). Клостридии (анаэробы) — палочковидные формы, образующие споры, превышающие по ширине вегетативную клетку. Такие формы напоминают веретено, ракетку, лимон, барабанную палочку.

Плеоморфизм – изменение формы в процессе развития. Клостридии принимают, участие во многих процессах в природе. Являются возбудителями анаэробных инфекций. Вызывают аммонификацию белковых веществ, мочевины. Разлагают фосфорорганические соединения. Фиксируют молекулярный азот.

Палочки, как и кокки, могут располагаться попарно или цепочкой. При соединении бактерий попарно образуются диплобактерии, при таком же соединении бацилл — диплобациллы.

Извитые формы микробов (Spirillaceae) определяют не только по длине и диаметру, но и по количеству завитков. Вибрионы напоминают по форме запятую.

Спириллы — извитые формы, образующие до 3—5 завитков, подвижны. Спирохеты — тонкие длинные извитые формы с множеством завитков. Подвижны. Имеют первичные (изгиб протоплазматического цилиндра) и вторичные (изгибы всего тела) завитки. Могут образовывать цисту.

По количеству и расположению жгутиков выделяют следующие бактерии: монотрихи — бактерии с одним полярно расположенным жгутиком , амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах; лофотрихи — бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки; перитрихи — бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Бактерии, не имеющие жгутиков, называют атрихиями. Нить жгутика состоит из 3 частей: крюк, базальное тельце. Наличие жгутиков у бактерий зависит от температуры их выращивания.

Бактерии передвигаются беспорядочно, однако они способны к направленным формам движения — таксисам, в зависимости от внешних стимулов. Реагируя на различные факторы окружающей среды, бактерии за короткое время локализуются в оптимальной зоне обитания. Таксис может быть положительным и отрицательным. Принято различать: хемотаксис, аэротаксис, фототаксис, магнитотаксис.

Тема №3 «Бактериологические красители. Техника приготовления окрашенных препаратов бактерий. Простые и сложные методы окраски»

Цель занятия: изучить состав красителей, научиться делать мазки и мазки-отпечатки, изучить методы и технику окрашивания.

Материалы и оборудование: предметные стекла, спиртовки, реактивы для окрашивания, фильтровальная бумага, сифон с дистиллированной водой.

Бактерии микроскопируют в живом и неживом виде. Исследование в живом состоянии необходимо для определения «подвижности» (метод «висячей» или «раздавленной» капли). Для изучения морфологии бактерий (формы и структурных элементов), тинкториальных особенностей (способность воспринимать окраску) применяют окрашивание в неживом состоянии.

Для окрашивания применяют анилиновые красители (основные и нейтральные), кислые краски непригодны (вследствие химического состава клетки). Для микроскопирования используют различные методы окрашивания, которые требуют красителей разного цвета: кристалл-, метил-, генцианвиолет – фиолетовый цвет; фуксин, сафранин – красный; метиленовый синий – синий; малахитовый или бриллиантовая зелень – зеленый. Эти красители поступают в продажу в виде порошка или кристаллов, из которых готовят насыщенный спиртовой раствор, но к непосредственной окраске они непригодны. Из насыщенных спиртовых растворов готовят водно-спиртовые растворы, путем добавления дистиллированной воды. Такие растворы менее стойкие, но применяются длительное время. В отдельных случаях готовят раствор красителей, которые используют в свежеприготовленном виде.

Для повышения действия спиртоводных растворов красок применяют протраву(разрушает клеточную оболочку). Физическая протрава нагревание: использование горячих растворов красителей или раствор краски наливают на препарат и снизу подогревают на пламени до появления паров. Химическая протрава фенол, КОН, которые добавляют к растворам красителей или перед окрашиванием препарат обрабатывают слабыми растворами кислот (HCl, H2SO4) после чего смывают водой и окрашивают. Из спиртоводных растворов используют: карболовый фуксин (фуксин Циля, фуксин Пфейффера), генцианвиолет, метиленовый синий (щелочной раствор Лефлера), водный раствор сафранина, малахитовая или бриллиантовая зелень.

Препарат для микроскопирования готовят на предметном стекле. Материалом может быть: гной, кровь, взвесь бактериальных культур – препараты-мазки, а из ткани органов (печень, селезенка, лимфоузлы) – препараты-отпечатки.

Высушенный на воздухе мазок фиксируют – закрепляют на стекле (и обеззараживают). Фиксация выполняет следующие функции: быстро убивает микроорганизмы (медленная гибель ведет к аутолизу), обеспечивает лучшее прилипание к стеклу, делает мазок более восприимчивым к окраске (у мертвых клеток нарушена целостность мембран). Физический способ оборотной стороной мазка 2-3 раза слегка проводят над пламенем горелки. Химический способ использование спирта, эфира, формалина, смеси Никифорова (спирт+эфир 1:1), жидкость Карнуа (спирт+хлороформ+ледяная уксусная кислота). Высушенный мазок опускают в стакан с фиксирующей жидкостью или капают 1-2 капли на препарат на 3-5 минут, промывают, сушат.

Окрашивание – совокупность методов и приемов для исследоания внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, матод микробиологической техники, позволяющие различать виды микроорганизмов.

Простой метод окраски. При данном методе используют только один краситель. На фиксированный препарат, помещенный на мостике над сливной чашкой, наливают красящий раствор (метиленовой сини 4. 5 мин, генцианвиолет 1-2 мин). Краску смывают водой из бутыли, препарат высушивают фильтровальной бумагой и наносят каплю иммерсионного масла. Готовый препарат помещают на предметный столик и микроскопируют. Данный метод позволяет быстро ознакомиться с микрофлорой мазка.

Сложные (дифференцирующие) методы окраски. Отличаются от простых методов тем, что препарат окрашивают несколькими красками, а в отдельных случаях используют еще специальные реактивы (раствор Люголя, кислоты и др.). Сложные методы позволяют выявить наличие (или отсутствие) отдельных структурных элементов и некоторых органических соединений клетки, чем и определяют тинкториальные свойства каждого вида микроба.


Метод окраски по Граму. Фиксированный препарат окрашивают карболовым генцианвиолетом в течение 2. 3 мин. Не смывая водой, краску сливают и на 2. 3 мин на препарат наносят раствор Люголя (йода кристаллического — 1 г; йодистого калия как растворителя йода — 2 г; дистиллированной воды — 300 мл). Раствор Люголя сливают; препарат, не промывая водой, обрабатывают 96%-м спиртом в течение 30 с, затем хорошо промывают водой. После этого препарат дополнительно окрашивают рабочим раствором фуксина (до 1 мин), вновь промывают водой, сушат фильтровальной бумагой и микроскопируют.

При окраске по Граму одни виды бактерий не обесцвечиваются спиртом после первичного окрашивания и сохраняют фиолетовый цвет; их называют грамположительными (фирмикутные). Другие виды обесцвечиваются спиртом, а затем воспринимают дополнительную окраску фуксином и приобретают розово-красный цвет; их называют грамотрицательными (грациликутные). Окрашивание по Граму обусловлено структурными особенностями клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных групп микробов, длиной и формой ее пор, неодинаковым химическим составом и строением пептидогликанового слоя клеточной стенки микроорганизмов. Генцианвиолет (или кристаллвиолет) и нуклеиновые кислоты цитоплазмы в присутствии йода (раствор Люголя) образуют прочный комплекс, нерастворимый в воде и слаборастворимый в спирте. Поэтому при действии спиртом в течение 30 с бактерии с многослойным пептидогликановым каркасом (грамположительные) не обесцвечиваются. У грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой имеет более крупные поры, что облегчает прохождение спирта; образовавшийся комплекс разрушается, клетка обесцвечивается.

Дата добавления: 2020-02-25 ; просмотров: 1730 | Нарушение авторских прав

Аллергологический метод исследования в микробиологии. Методы исследований в микробиологии. Аппликационные кожные тесты

Аллергические заболевания – это группа болезней, которые обусловлены повреждением, вызываемым иммунной реакцией на экзогенные аллерге­ны. В основе развития этих заболеваний лежат различные типы реакций гиперчувствительности. Они вызывают воспаление, которое является морфологическим признаком большинства аллергических болезней.

К числу аллергических болезней относятся:

Атопическая бронхиальная астма

Крапивница и отек Квинке

Экзогенный аллергический альвеолит

Контактный аллергический дерматит

В настоящее время при описании аллергических болезней используют два принципа: нозологический и этиологический. Первый является основным и предусматривает написание в диагнозе названия определенной болезни (см. выше.). Второй, как правило, используется в сложных случаях, когда в пато­логический процесс у пациента вовлечено несколько органов и систем. Он предполагает указание на первом месте причины расстройства (например, пищевая аллергия, лекарственная аллергия, инсектная аллергия, поствакцинальные аллергические осложнения, физическая аллергия и т.д.). Диаг­ностикой и лечением аллергических заболеваний занимается врач аллерго­лог-иммунолог, что отражено в соответствующих нормативных документах Минздрава РФ.

Из аллергических заболеваний наиболее часто в клинической практике встречаются атопические болезни, которые обусловлены IgЕ-зависимыми реакциями гиперчувствительности. К их числу относят атопическую БА, поллиноз, аллергический ринит и атопический дерматит, которые имеют наибо­лее высокое медико-социальное значение.

Классификация аллергических реакций

Термин аллергия (allos – иной, ergos – действие) впервые предложил Von Pirquet в 1906 году для обозначения измененной реактивности человека на антигенную стимуляцию, независимо от того, приводит ли она к формирова­нию иммунитета или повышенной чувствительности.

В настоящее время под аллергией понимают иммунологически опосредо­ванную гиперчувствительность организма к чужеродным веществам, возника­ющую в ответ на повторный контакт с ними. Важнейшими характеристиками этого понятия являются высокая специфичность (т.е. способность развиваться лишь в ответ на определенные антигены) и возможность развития только в сен­сибилизированном (т.е. подготовленном для того) организме. Они широко ис­пользуются для диагностики и лечения аллергических заболеваний.

Вещества, вызывающие развитие реакций гиперчувствительности, назы­ваются аллергенами. Их участки, распознаваемые иммунной системой, называются антигенными детерминантами (эпитопами). Различные родственные аллергены могут иметь одинаковые эпитопы, за счет чего у больных возможно возникновение пере­крестной сенсибилизации.

В отличие от иммунных реакций, которые протекают бессимптомно и направлены на защиту организма от чужеродного вещества, аллергические реакции сопровождаются повреждением тканей и появлением соответствующих клинических признаков заболеваний.

Сенсибилизацией называется процесс формирования повышенной чув­ствительности организма к аллергенам. Она характеризуется образованием специфических антител или сенсибилизированных лимфоцитов, которые при повторном поступлении чужеродного вещества участвуют в развитии аллергических реакций. Сенсибилизация может возникать активно (т.е. при естественном или искусственном попадании аллергена) или пассивно (т.е. при введении в организм антител или лимфоцитов от другого человека, имеюще­го повышенную чувствительность).

В развитии любой аллергической реакции условно выделяют три стадии А. Д. Адо :

Иммунологическая стадия . Она охватывает все изменения в иммунной системе, возникающие с момента поступления аллергена в организм до обра­зования антител или сенсибилизированных лимфоцитов и соединение их с повторно поступившим или циркулирующим аллергеном.

Патохимическая стадия . Характеризуется образованием медиаторов и их высвобождением из клеток в ответ на действие аллергена.

Патофизиологическая стадия . Заключается в действии медиаторов че­рез рецепторы на ткани и возникновении клинических симптомов гиперчувствительности.

По времени возникновения после контакта с аллергеном различают не­медленные, отсроченные и замедленные аллергические реакции.

Немедленные реакции возникают через несколько минут (обычно через 15–20 мин) или ранее после воздействия антигена, отсроченные – через несколь­ко часов (как правило, через 4–6 ч), замедленные – через 24–72 ч.

В развитии немедленных и отсроченных реакций принимают участие ан­титела, замедленных – сенсибилизированные клетки.

По механизмам развития выделяют анафилактический, цитотоксический, иммунокомплексный и клеточно-опосредованный типы гиперчувствительности .

I тип (IgE-зависимый, анафилактический) характеризуется участием реагинов (IgE, IgG), которые за счет длинного Fc-фрагмента фиксируются на поверхности тучных клеток и базофилов (клетки-мишени аллергии I порядка). При взаимодействии иммуноглобулинов с аллергенами клетки начинают продуцировать первичные и вторичные медиаторы, которые при действии на ткани определяют развитие клинических симптомов заболеваний. В последние годы классическая схема этой реакции дополнена представлени­ем о поздней фазе, которая характеризуется участием клеток-мишеней аллергии 2 порядка (эозинофилы, макрофаги, нейтрофилы и др.). Они участвуют в развитии аллергического воспаления. К заболеваниям, в которых участвует IgE-зависимая гиперчувствительность относятся атопическая бронхиальная астма, поллиноз, аллергический ринит, крапивница и отек Квинке, атопический дерматит, анафилактический шок.

В настоящее время под атопией понимают генетически детерминированную способность к продукции IgE к наиболее распространенным (обычно по­ступающим ингаляционно) аллергенам. В отличие от этого, для анафилаксии не характерна наследственная предрасположенность. Она может развиваться у более широкого круга людей при поступлении аллергена различными путями (инъекционными, энтеральным и др.). В связи с этим атопических болезней меньше, чем нозологических форм, в основе которых лежит IgE-зависимая гиперчувствительность.

II тип (цитотоксический) отличается тем, что антигены фиксируются на поверхности клеточной мембраны или являются ее компонентами. Реакция характеризуется участием клеток-киллеров (К-клеток), вступающих в реакцию за счет молекулы антитела (IgG или М), которая Fc-фрагментом соедине­на с К-клеткой, а антиген-связывающим участком – с поверхность клетки-мишени. Разрушение антигена осуществляется также за счет активации сис­темы комплемента. Примерами цитотоксической гиперчувствительности являются лекарственные цитопении, гемотрансфузионные реакции, гемолитическая болезнь новорожденных и др.

Ill тип (иммунокомплексный) зависит от образования иммунных комп­лексов. В них отмечаются различные соотношения антител и антигена. Ком­плексы, образованные при избытке антител и при эквивалентном соотношении антигена и антител, обычно легко удаляются из кровотока фагоцитами. Комплексы, образованные при большом избытке антигенов, циркулируют длительное время, но обладают слабым повреждающим действием. Наиболь­шая патогенная активность присуща комплексам, в которых отмечается не­большой избыток аллергена по отношению к иммуноглобулинам. Это соотно­шение оптимально для их отложения в сосудистой стенке, активации комп­лемента и тромбообразования.

Иммунокомплексный тип гиперчувствительности участвует в развитии сывороточной болезни, феномена Артюса (местной иммунокомплексной ре­акции на введение аллергена), васкулитов, аутоиммунных заболеваний и др.

IV тип (клеточно-опосредованная, замедленная, туберкулиновая гиперчувствительность) заключается во взаимодействии сенсибилизированного Т-лимфоцита с антигеном. Это стимулирует секрецию лимфокинов и активирует макрофаги. Невозможность элиминации аллергена приводит к формированию гранулемы. Клеточно-опосредованная гиперчувствительность лежит в основе контак­тного аллергического дерматита, инфекционных заболеваний (туберкулез, вирусные инфекции и др.), реакциях отторжения трансплантата.

Следует отметить, что клинические проявления аллергических заболеваний, как правило, обусловлены несколькими типами реакций гиперчувстви­тельности, один из которых является ведущим. Примером этого является ле­карственная аллергия, в развитии которой могут принимать участие все четыре типа реакций, анафилактический шок (I иIII тип), эозинофильный ле­гочный инфильтрат (I и III тип) и др. Тем не менее, рассмотренная выше классификация сохраняет свое значение в клинической практике. Она удачно систематизирует разнообразные заболевания и объясняет различные подходы к их диагностике и лечению.

Общие принципы диагностики аллергических заболеваний

Диагностика аллергических заболеваний основана на тех же принципах, что и распознавание других болезней. Ее особенностью является направлен­ность на выявление причины заболевания для элиминации этиологически значимого аллергена.

Специфическая диагностика включает 4 основных метода обследования больных:

Сбор аллергологического анамнеза.

Обследование больного начинают со сбора жалоб, характер которых ука­зывает на определенную группу заболеваний. Обязателен анализ анамнеза болезни, при сборе которого обращают внимание на ее продолжительность, начало и первые симптомы, динамику развития, результаты предшествую­щей диагностики и лечения. При сборе анамнеза жизни осуществляется поиск факторов, способствующих развитию данного заболевания.

Аллергологический анамнез является первым и чрезвычайно важным этапом специфической диагностики. Его задачами являются: 1) установле­ние наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям; 2) определение аллергена или группы аллергенов, ответственных за развитие данной патологии; 3) формулировка предварительного диагноза.

Анамнестические признаки бытовой аллергии:

Эффект элиминации, заключающийся в уменьшении или исчезновении симптомов болезни, когда больные находятся вне домашней обстановки (в больнице, на даче, в командировке, в отпуске и т.д.).

Круглогодичное течение заболевания с обострениями в холодное время года (осенью, зимой, ранней весной). Это связано с тем, что в этот период по­вышается насыщенность пылью жилищ и увеличивается численность в них клещей.

Появление симптомов ночью, особенно в первую ее половину. Причиной этого является тесный контакт больных с аллергенами из постельных принадлежностей.

Возникновение клинических проявлений при уборке квартиры, посещении подвалов, чуланов, вытряхивании ковров.

Клиническими проявлениями сенсибилизации к аллергенам животных являются БА и аллергический ринит, реже – экзогенный аллергический альвеолит, крапивница, атонический дерматит.

Особенности аллергологического анамнеза при эпидермальной аллергии:

Возникновение симптомов при контакте с животными. В связи с высокой активностью аллергенов больные нередко сами указывают врачу на этот признак.

Клинические проявления могут возникать при ношении одежды из шерсти и меха.

Непереносимость препаратов, содержащих белки животных (гетерологичные сыворотки, иммуноглобулины и т.д.).

Анамнестические признаки пыльцевой аллергии:

Сочетание у больного аллергического ринита, конъюнктивита и БА.

Сезонность обострении (появление признаков болезни в теплое время года – весной, летом, осенью в период пыления растений).

Метеозависимость (ухудшение самочувствия больных в сухую ветреную погоду, когда создаются наилучшие условия для распространения пыльцы).

Перекрестная пищевая сенсибилизация. В этом случае заболевание может приобретать круглогодичное течение.

Проявлениями пищевой аллергии чаще всего являются заболевания пи­щеварительной системы (аллергический стоматит, хейлит, гастрит, колит, гастроэнтерит, синдром раздраженной кишки), кожи (атопический дерматит, крапивница, отек Квинке) и реже – органов дыхания (аллергический ринит, астма). В случае выраженной сенсибилизации возможен анафилактический шок.

Особенности аллергологического анамнеза при пищевой аллергии:

Появление или прогрессирование симптомов заболевания после приема пищи (через несколько минут или часов). Иногда реакция может возни­кать от запахов пищи (например, рыбы).

Сочетание аллергических заболеваний кожи (атопического дерматоза, хронической рецидивирующей крапивницы, отеков Квинке) и БА.

Наличие хронических заболеваний органов пищеварения (хронического гастрита, холецистита, панкреатита, колита, дисбактериоза кишечника и др.).

Большое значение для диагностики пищевой сенсибилизации имеет ведение больными дневника.

Лекарственная аллергия может иметь разнообразные клинические про­явления. При наличии у больного указаний на непереносимость медикаментов следует помнить о следующих закономерностях ее развития:

1. Аллергические реакции возникают у небольшого числа больных (при­мерно у 2–3% взрослых, получавших препарат).

2. Лекарственная аллергия может развиваться только в том случае, если больной сенсибилизирован данным препаратом или средством, имеющим с ним общие антигенные детерминанты. Ее развитие вызывают те медикаменты, которые пациент получал ранее.

3. Как правило, сенсибилизация к лекарствам развивается в течение дли­тельного времени (недели и месяцы). Однако у больных аллергическими за­болеваниями она может появляться через 7–9 дней после приема препарата. Наиболее часто гиперчувствительность развивается при парентеральном вве­дении лекарств.

4. Лекарственная аллергия не напоминает фармакологического действия препаратов.

5. Аллергическая реакция не зависит от дозы препарата и может возни­кать от его минимального количества (плохо промытый шприц, загрязнен­ный воздух процедурной и т.д.).

6. Лекарственная аллергия проявляется классическими симптомами ал­лергических заболеваний (крапивница, отек Квинке, БА, анафилактический шок и др.).

Промышленные аллергены наиболее часто вызывают развитие профес­сиональной бронхиальной астмы, ринита, экзогенного аллергического альвеолита, контактного аллергического дерматита.

При сборе анамнеза у больного с подозрением на профессиональную ал­лергию следует обратить внимание на санитарно-гигиенические условия ра­бочего места пациента и его профмаршрут. Необходимо получить докумен­тально подтвержденный перечень веществ, с которыми контактирует больной в процессе работы. В типичных случаях при профессиональной аллергии характерны следующие особенности:

1. Как правило, болезнь развивается после определенного латентного пе­риода, необходимого для формирования сенсибилизации (период экспозиции). Его продолжительность зависит от характера профессиональных вредностей и соблюдения техники безопасности на рабочем месте. Время экспозиции мо­жет составлять от нескольких месяцев (соли платины) до нескольких лет (изоцианаты, канифоль и др.).

2. Эффект элиминации, заключающийся в улучшении состояния больного после прекращения действия производственных факторов, т.е. во время отпуска, командировок, выходных дней, госпитализации в стационар и т.д.

3. Синдром реэкспозиции, характеризующийся появлением симптомов болезни при возобновлении работы (например, симптом «понедельника» при биссинозе). Следует помнить, что химические вещества могут вызывать ранние (через несколько минут), отсроченные (через несколько часов) поздние (через несколько дней) и двойные реакции. Поэтому изменение самочувствия может наблюдаться не сразу, а спустя продолжительное время после возоб­новления и прекращения контакта с профессиональными факторами.

Грибковые аллергены наиболее часто вызывают развитие БА, аллерги­ческого ринита, реже – экзогенного аллергического альвеолита, крапивницы и отека Квинке.

Особенности анамнеза при грибковой сенсибилизации:

Непереносимость дрожжесодержащих продуктов (пива, кваса, сухих вин, молочно-кислых продуктов и антибиотиков пенициллинового ряда).

Ухудшение состояния во влажную погоду, а также при посещении сырых, плохо проветриваемых помещений.

Сезонное или круглогодичное течение болезни, что связано с особенностями грибов, вызывающих его развитие. Известно, что концентрация грибов Alternaria, Cladosporium, Candida увеличивается весной, летом и в начале осени. Поэтому самочувствие больных ухудшается в теплое время года. Количество грибов рода Penicillium и Aspergillus в воздухе остается высоким в течение всего года. У сенсибилизированных больных отмечается круглогодичное течение болезни.

Профессиональный контакт с грибами (работники птицеферм, пище­вой, фармацевтической промышленности, вивариев и др.).

Наличие очагов грибковой инфекции (онихомикозы, грибковый дисбиоз и др.).

Физикальное обследование позволяет провести объективный анализ имеющихся у больного симптомов. Оно проводится по общепринятым правилам. Объективные признаки аллергических заболеваний приведены в соответству­ющих разделах книги.

Показанием для их постановки является наличие у больного данных аллергологического анамнеза, указывающих на роль одного или нескольких аллергенов в возникновении болезни.

Противопоказания для кожного тестирования:


Обострение основного заболевания.

Тяжелое течение астмы (ОФВ,
Особо необходимо выделить группу заболеваний, связанных с повреждением легочной ткани иммунными механизмами под действием экзогенных аллергенов — спор грибов, белковых антигенов. Так как экзогенные аллергические альвеолиты связаны с вдыханием тех или иных профессиональных аллергенов, они носят названия, соответствующие профессии, например «легкое фермера», «легкое меховщиков», «легкое молольщиков кофе», «легкое голубеводов» и т. д.
В настоящее время известно более 20 профессий, при которых возникают экзогенные альвеолиты, в основе которых лежат иммунологические механизмы (реакция «аллерген — антитело»).

Особенностью этих механизмов является образование преципитирующих антител, которые, соединяясь с аллергеном, образуют иммунные комплексы, оседающие в стенках альвеол, мелких бронхов. Отложению иммунных комплексов способствует повышенная проницаемость сосудистой стенки. В течении аллергического экзогенного альвеолита прослеживаются все 3 типа аллергических реакций (см. гл. 2).

Заболевают экзогенным легочным альвеолитом люди, предрасположенные к аллергическим реакциям, после длительного контакта с аллергеном. Течение заболевания может быть острым, подострым и хроническим. Иногда альвеолит протекает периодически в виде острых вспышек при вдыхании больших доз аллергена (чистка голубятни, переборка прелого сена, работа на мельнице).
При острой форме заболевание нередко трактуется как пневмония, так как имеется обилие физикальных данных (хрипы влажные, мелкопузырчатые), увеличенная СОЭ, лейкоцитоз.

В процессе заболевания в легочной ткани происходят необратимые изменения, связанные с образованием гранулем и рубцеванием, которые ведут к развитию фиброза легких.

В острой и подострой стадиях показано применение глюкокортикоидных гормонов. Профилактика заключается в предупреждении контактов больных с соответствующим аллергеном (перемена профессии). Хроническая форма экзогенного аллергического альвеолита плохо поддается лечению, обычно проводится симптоматическая терапия.

Аллергологический метод исследования (АЛМИ) используется для выявления в организме Ат или сенсибилизированных Т-лимфоцитов к аллергену.

диагностика хронических инфекционных заболеваний, в патогенезе которых имеет место сенсибилизация к микробным антигенам (ГЗТ);

диагностика аллергических заболеваний (ГНТ);

разработка специфической десенсибилизирующей терапии реакций ГНТ медиаторного типа.

I этап алми. Сбор аллергологического анамнеза с целью:

установления наследственной предрасположенности к аллергии;

выявления факторов, отягощающих личный аллергологический анамнез:

– перенесенных острых заразных и инфекционных заболеваний;

– наличия в данное время или в анамнезе хронических воспалительных заболеваний (хронический тонзиллит, синусит, ринит, холецистит, колит, хронические язвы кожи, микробная экзема, фурункулёз, кожные грибковые заболевания);

– выявление пищевой аллергии, ингаляционной аллергии, инсектной аллергии, контактных дерматитов;

– получение сведений о профилактических прививках и реакциях на них;

– получение сведений о введении гетерологичных сывороток и реакциях на них;

– получение сведений о реакциях на введение антибиотиков, частоте применения антибиотиков, сведения о непереносимости других лекарств.

установление эффекта элиминации аллергена: связи между контактом с аллергеном и изменением состояния пациента.

Так, аллергию к клещам домашней пыли можно заподозрить при развитии обострений, связанных с уборкой помещения, работе с книгами. При смене места проживания выраженность симптомов часто уменьшается, иногда вплоть до полной клинической ремиссии, в виду отсутствия контакта с аллергенным триггером.

При аллергии на производственные аллергены наблюдается ухудшение состояния после выходных («эффект понедельника»).

При лекарственной аллергии отмечается смягчение или исчезновение симптомов аллергии после отмены препарата.

предположения по группе аллергена:

– связь с простудными заболеваниями у больных с инфекционно-аллергической бронхиальной астмой, аллергическим ринитом;

Так, при поллинозах связь обострения заболевания с периодом цветения растений обычно настолько очевидна, что проведение аллергологического обследования становится необходимым лишь с целью уточнения спектра аллергенов для проведения специфической десенсибилизации.

Атопический дерматит, обусловленный гиперчувствительностью к аллергенам домашней пыли и плесневых грибов, обостряется ранней весной еще до цветения растений и поздней осенью (больше времени проводится в помещении).

– наличие наследственной предрасположенности при медиаторном типе ГНТ;

5) дифференциации пищевой аллергии с парааллергией (употреблением большого количества продуктов, содержащих биологически активные амины, что имитирует патофизиологическую стадию медиаторного типа ГНТ) и идиосинкразией (непереносимостью отдельных продуктов, например, молочных, обусловленной ферментопатией).

В диагностике пищевой аллергии существенное значение имеют сведения, четко указывающие на связь обострения с приемом конкретного пищевого продукта. При этом учитывается только обострение, которое развивается во временном диапазоне от нескольких минут до 4 часов с момета употребления в пищу подозреваемого продукта.

Существенное значение для выявления пищевых аллергенов имеет установление непереносимости продуктов, сходных по антигенной структуре с подозреваемым аллергеном. Например, пациенты, имеющие аллергию на куриное яйцо, чаще всего не переносят и мясо курицы. При непереносимости коровьего молока нередко отмечается аллергия на говядину.

II этап АЛМИ. Постановка кожно-аллергических проб предполагает введение предполагаемого аллергена в организм больного.

А. Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований.

Кожно-аллергические реакции при инфекционных заболеваниях появляются относительно рано (с 4–5 дня болезни), достигают наибольшей интенсивности на 2–3 неделе болезни. В зависимости от выраженности или напряженности аллергического процесса положительная реакция может сохраняться годами (напр., при бруцеллёзе) или исчезать довольно быстро, в течение нескольких недель-месяцев (напр., при дизентерии). Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю (рис. 50, 51).

Кожно-аллергические пробы для диагностики ГЗТ предполагают внутрикожное введение Аг (аллергена). Аллергенные препараты готовятся специальными учреждениями – институтами вакцин и сывороток. Предполагаемый аллерген вводят внутрикожно в объёме 0,1 мл. Результат учитывают через 24–72 часа после введения аллергена по диаметру папулы (инфильтрата).

Рис. 50. Постановка пробы Манту

Рис. 51. Учет пробы Манту

Б. Кожные тесты используются при диагностике ГНТ медиаторного типа. Введенные в практику в 1911 году, кожные тесты остаются одним из самых достоверных диагностических тестов in vivo. Именно кожные тесты являлись и являются ориентиром для определения достоверности всех тестов in vitro. Кожное тестирование – ценный метод диагностики сенсибилизации, который широко используется во всех странах мира.

Для кожных тестов используют растворы аллергенов: трав, пыльцы, эпидермиса животных, яда насекомых, пищи, лекарств. Степень диагностической чувствительности кожных проб увеличивается в следующем порядке: капельная, аппликационная (накожная), укол (прик-тест), скарификационная (через царапину), внутрикожная.

Капельные пробы – аллерген наносится на неповреждённую кожу в виде капли.

Аппликационные пробы – раствором аллергена смачивают марлевый тампон и накладывают его на неповрежденный участок кожи (внутренней поверхности предплечья или спины). Затем этот участок заклеивается перфорированным лейкопластырем (рис. 52).

Рис. 52. Аппликационные пробы на коже спины

Оценка результатов проводится как в течение первого часа после нанесения на кожу аллергена (ГНТ), так и спустя 24–48 часов (ГЗТ). Оцениваются гиперемия кожи, зуд, отечность, мокнутие в месте нанесения вещества. Аппликационные тесты незаменимы для оценки индивидуальной переносимости различных наружных средств для лечения и ухода за кожей.

Скарификационные пробы – на чистую кожу предплечья наносят капли аллергенов, через них одноразовым скарификатором делают небольшие царапины (рис. 53).

Рис. 53. Постановка скарификационных проб

Прик-тесты – на чистую кожу предплечья наносят капли аллергенов, через них одноразовыми иглами делают легкие уколы (на один миллиметр в глубину).

Внутрикожные тесты – разведенный 1:100 (по отношению к кожным тестам) аллерген вводят внутрикожно в кожу предплечья в объёме 0,1 мл. Внутрикожные тесты ставятся с ингаляционными аллергенами в сложных диагностических ситуациях, когда клинические данные убедительно свидетельствуют о наличии сенсибилизации, а результаты кожных тестов сомнительны. Внутрикожные тесты с пищевыми аллергенами проводить категорически запрещено из-за их чрезмерной чувствительности и возможности провокации анафилактической реакции.

Противопоказания к кожному тестированию:

– обострение текущего аллергического заболевания;

– острое инфекционное заболевание (ОРВИ, ангина и др.);

– хроническое заболевание в стадии декомпенсации;

– туберкулезный процесс любой локализации в период обострения;

– психическое заболевание в период обострения;

– длительная терапия кортикостероидами или местное их применение в области кожи, где предполагается проведение проб (отказаться за 2 недели до проведения проб);

– прием антигистаминных препаратов (отказаться за сутки до проведения проб);

– возраст старше 60 лет.

В таких ситуациях кожное тестирование запрещается или откладывается.

Кожное тестирование проводить нецелесообразно при:

– указании в анамнезе на острую реакцию к определенному аллергену (для исключения возможных анафилактических реакций);

– отсутствии подозрений на аллергическую природу заболевания;

– отказе родителей больного ребенка или самого больного от проведения тестирования;

– наличии у больного выраженного дермографизма;

– наличии у пациента инфекционных заболеваниях кожи или поражения кожи (отсутствии непораженных участков для проведения тестирования).

В этаких ситуациях кожное тестирование откладывают или используют лабораторные методы диагностики.

Аллергологические пробы проводятся в процедурном кабинете аллергологического отделения под контролем врача-аллерголога.

За один раз проводится не более 15 проб с различными аллергенами и 2 контроля. Положительный контроль содержит гистамин и указывает на то, что соблюдены все условия постановки теста. Отрицательный контроль содержит жидкость, которая не должна вызывать каких-либо кожных реакций (напр., изотонический раствор хлорида натрия). Результаты постановки кожных проб оцениваются относительно контролей. Если пациент перед проведением кожной пробы принимал антигистаминные препараты, то положительный контроль и пробы на аллергены не дадут реакции.

Положительный результат ГНТ регистрируется, если через 20 минут после контакта с аллергеном:

– наблюдаются везикула (волдырь) или эритема;

– наблюдается только эритема диаметром больше 20 мм;

– имеются признаки общей реакции (головокружение, тошнота).

При этом степень кожной реакции на аллерген оценивают по шкале от одного (+) до четырех (++++) плюсов:

+ – везикула или эритема до 3 мм;

++ – везикула или эритема до 6 мм;

+++ – везикула или эритема до 10 мм;

++++ – везикула или эритема более 10 мм.

Положительный контроль должен показать реакцию на ++ или +++, а отрицательный контроль – ничего не показать.

Рис. 54. Результаты кожных проб

Положительные результаты кожного тестирования свидетельствуют только о наличии сенсибилизации к аллергену и не являются доказательством его причинной значимости в возникновении заболевания. Аллерген, кожная проба на который положительна, можно считать причиной заболевания, только в том случае, если это совпадает с клиническими проявлениями и данными анамнеза. В то же время своевременное выявление сенсибилизации к аллергенам играет решающую роль при назначении профилактических мероприятий.

Если подозревалась аллергия на конкретный аллерген, а результат кожной пробы отрицателен, это не исключает аллергию на этот аллерген. Проба может быть повторена с другими сериями того же аллергена, так как разные серии аллергенов в зависимости от стандартизации аллергенов и индивидуальной чувствительности могут действовать по-разному. Кроме того, следует учитывать, что чувствительность кожи и слизистых оболочек (конъюнктивы глаз, слизистой носа) отличаются от друга. Поэтому при несовпадении результатов или сомнении ставят элиминационно-провокационные пробы.

Необходимость в проведении элиминационно-провокационных тестов чаще всего возникает у больных с атопическим дерматитом, так как у них наблюдаются положительные кожные пробы к множеству пищевых аллергенов, в то время как клинически значимыми обычно оказываются 1–3 пищевых продукта. Если в таких ситуациях, основываясь только на результатах кожных тестов, без проведения элиминационно-провокационного тестирования, исключить из питания множество продуктов, это будет неоправданным.

III э тап АЛМИ. Постановка провокационных проб предполагает воспроизведение симптомов аллергической реакции через принудительный контакт с аллергеном в период ремиссии.

Провокационные пробы применяют по строгим показаниям, когда имеются расхождения между данными анамнеза, результатами кожных проб и данными лабораторного обследования. При наличии аллергии на конкретный препарат, ставить провокационные тесты не рекомендуется. Провокационные пробы проводят в специализированных центрах, так как шоковая реакция возможна даже на микрограммы препарата.


Для провокационных проб могут быть использованы пероральный (пищевой), конъюнктивальный, назальный, ингаляционный или холодовой тесты. Если в ответ на введение предполагаемого аллергена развивается аллергическая реакция, то аллерген может считаться причинно значимым.

IV этап АЛМИ. Постановка элиминационных тестов. Элиминационные тесты используют для подтверждения причинного аллергена, если с ним имеет место постоянный контакт (напр., при пищевой аллергии). Элиминационная диета, исключающая определённые продукты, обладающие сесибилизирующим действием на организм пациента, назначается на 1-2 недели. При улучшении состояния пациента проводится провокационная проба, подтверждающая причинный аллерген.

V этап АЛМИ. Лабораторные методы выявления эффекторных молекул Ат и биологически активных аминов, а также сенсибилизированных лимфоцитов к аллергенам, опосредующих клинические проявления аллергических реакций. Лабораторные методы диагностики аллергии используются при наличии противопоказаний к кожным тестам. Лабораторные методы диагностики аллергии подробно изучаются в курсе иммунологии.

После аллергологического обследования пациента врач заполняет паспорт больного аллергией – медицинский документ, содержащий все сведения об аллергическом заболевании, которым страдает данный человек. Паспорт (или его копию) страдающий аллергией должен всегда иметь с собой и предъявлять при обращении за медицинской помощью.

ранний метод диагностики ГНТ. При постановке кожно-аллергических проб можно выявить сенсибилизацию к определённому аллергену (напр., домашней пыли, стрептококкам) даже без признаков реализации в аллергическую реакцию. Кожно-аллергические пробы используются также для определения состояния сенсибилизации к антибиотикам и гетерологичным сывороткам.

быстрота получения результатов при постановке кожно-аллергических проб для диагностики ГНТ.

лабораторные методы диагностики ГНТ in vitro предпочтительны по безопасности и возможности использования в любой период заболевания. Они имеют основное значение в случаях, когда нельзя применять кожно-аллергические пробы и провокационные тесты.

выявление причинного аллергена позволяет проводить патогенетически обоснованную десенсибилизирующую терапию; этот подход наиболее успешно в настоящее время используется при поллинозах (пыльцевой аллергии).

Реферат: Методы микробиологической диагностики

Шаровидные Палочковидные Извитые
микрококки (одиночные) собственно бактерии спириллы
диплококки (пары) спорообраэующие спирохеты
стрептококки (цепочки) (бациллы, клостридии) кампилобактеры
тетракокки (4 клетки) изогнутые палочки
сарцины (тюки, пакеты) (вибрионы)
стафилококки (гроздья)

    ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………2
    Организация лабораторной микробиологической службы..2
    Принципы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний……………………………………………4
    Методы выделения и идентификации бактерий…………………5
    Методы идентификации нуклеиновых кислот…………………19
    Методы обнаружения вирусов…………………………………………23
    Методы дианостики грибковых инфекций……………………….27
    Методы обнаружения простейших…………………………………..29
    ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………….30

Микробиологическая диагностика в первую очередь необходима для определения причины инфекционных заболеваний. Существует 5 основных методов лабораторной диагностики: микроскопический, бактериологический, биологический, серологический и аллергический. Их принципы мы и рассмотрим в данном реферате. Также рассмотрим вопросы организации лабораторной микробиологической службы, методы выделения и иденти­фикации бактерий, обнаружения вирусов, грибов и простейших. Данная тема очень актуальна в наше время, так как с развитием общества и с увеличением численности населения все более масштабным становится распространение инфекций и своевременное обнаружение их носителей способно предотвратить возникновение эпидемий. Благо сейчас биологи уже способны определить множество инфекций, но, сколько ещё не найдено. А обнаружение новых микроорганизмов, вызывающих заболевания, позволяет своевременно найти способ лечения. Так что есть ещё простор для мысли и опытов. Думаю, самое время перейти к уже известным нам способам распознавания микроорганизмов. Начнём с места проведения диагностики: с лабораторий.

ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБЫ

Объект изучения медицинских микробиологических лаборато­рий — патогенные биологические агенты (ПБА) — патоген­ные для человека микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибы, про­стейшие), генно-инженерно модифицированные микроорганизмы, яды биологического происхождения (токсины), гельминты, а также ма­териал (включая кровь, биологические жидкости и экскременты организма человека), подозрительный на содержание ПБА. В зави­симости от выполняемых исследований, микробиологические лабо­ратории подразделяют на диагностические, производственные и научно-исследовательские. В соответствии с типами микроор­ганизмов, изучаемых в них, выделяют бактериологические, ви­ русологические, микологические и протозоологические ла­боратории. С возбудителями инфекционных заболеваний работа­ ют только в специализированных лабораториях, обеспечивающих безопасность её персонала и невозможность «утечки» патогенных микроорганизмов за пределы лаборатории.

Группы возбудителей инфекционных заболеваний

Регламентация условий работы с возбудителями инфекционных заболеваний произведена в соответствии со степенью опасности микроорганизмов для человека. По этому признаку выделено четы­ ре группы возбудителей.

Группа I : возбудители особо опасных инфекций: чума, натураль­ная оспа, лихорадки Ласса, Эбола и др.

Группа II : возбудители высококонтагиозных бактериальных гриб­ковых и вирусных инфекций: сибирская язва, холера, лихорадкаСкалистых гор, сыпной тиф, бластомикоз, бешенство и др. В эту группу также включён ботулотоксин (но не сам возбудитель ботулизма).

Группа III : возбудители бактериальных грибковых, вирусных и протозойных инфекций, выде­ленных в отдельные нозологические формы (возбудители коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулёза, кандидоза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита и др.). В эту группу также включены аттенуированные штаммы бактерий групп I, II и III.

Группа IV : возбудители бактериальных, вирусных, грибковых септицемии, менингитов, пнев­моний, энтеритов, токсикоинфекций и острых отравлений (возбудители анаэробных газовых инфекций, синегнойной инфекции, аспергиллёза, амебиаза, аденовирусы, герпесвирусы и др.).

Лаборатории разных групп риска

В зависимости от уровня безопасности работы с микроорганизмами лаборатории подразделя­ют на четыре группы риска.

Первая группа риска: лаборатории особого режима (максимально изолированные) с высокиминдивидуальным и общественным риском.

Вторая группа риска: режимные лаборатории (изолированные) с высоким индивидуальным инизким общественным риском.

Третья группа риска: базовые (основные) лаборатории с умеренным индивидуальным и ограни­ченным общественным риском.

Четвёртая группа риска: базовые (основные) лаборатории с низким индивидуальным и общест­венным риском.

Бактериологические лаборатории

В системе Министерства здравоохранения и Государственного комитета санитарно-эпидемио­логического надзора РФ наиболее разветвлена сеть бактериологических лабораторий. В соот­ветствии с выполняемыми задачами выделяют:

• бактериологические лаборатории в составе ЛПУ;

• бактериологические лаборатории в составе комитетов Госсанэпиднадзора;

• учебные бактериологические лаборатории вузов;

• проблемные и отраслевые бактериологические лаборатории научно-исследовательских инсти­тутов и предприятий по выпуску бактерийных препаратов;

• специализированные бактериологические лаборатории по контролю за особо опасными ин­фекциями;

• специализированные бактериологические лаборатории по контролю за отдельными группами бактерий: микобактериями, риккетсиями, лептоспирами и др.

Большая часть микробиологических лабораторий работает с ПБА групп III и IV , а изуче­нием возбудителей особо опасных инфекций (группы I и II ) занимаются только специализи­ рованные лаборатории.

Требования к организации работы с ПБА групп опасности III и IV

Базовые лаборатории, работающие с ПБА групп III и IV, должны располагаться в отдельном здании или в изолированной части здания. Они должны иметь два выхода: один для сотрудников, другой — для доставки материала для исследований (допускается передача материала через пере­даточное окно). В лабораториях вузов, научно-исследовательских институтов и на предприятиях по выпуску бактерийных препаратов допускается наличие одного входа. Лаборатории должны иметь необходимый набор помещений в соответствии с производственной мощностью и номенкла­турой выполняемых исследований. В них должны быть проведены водопровод, электричество, отопление и вентиляция. В системе водоснабжения должны быть предусмотрены раздельные сети подачи воды для лабораторных исследований и бытовых нужд (сеть питьевой воды). Последняя должна быть защищена от обратного тока воды из лабораторной сети. Вентиляция должна быть приточно-вытяжной, при этом наиболее низкое давление вытяжной вентиляции должно быть в помещениях с наибольшей опасностью инфицирования. При необходимости вентиляцию следует оснастить фильтрами тонкой очистки воздуха. Помещения должны иметь естественное и искусст­венное освещение. Каждая лаборатория должна иметь «чистую» и «грязную» зоны. Их планиров­ка и размещение оборудования должны обеспечивать «проточность>> продвижения ПБА по «грязной» зоне.

«Грязная» зона включает помещения для приёма и регистрации материала, боксы и комнаты дляпроведения микробиологических исследований, помещения для проведения серологических исследований, комната для проведения люминесцентной микроскопии, термостатная, автоклавная для обеззараживания материала. Окна и двери всех помещений должны герметично закрываться. Приточно-вытяжная вентиляция «грязной» зоны должна быть оборудована фильтрами тонкойочистки выбрасываемого воздуха. Помещения для проведения работ с живыми ПБА долж­ны быть оборудованы бактерицидными лампами. Обязательна маркировка автоклавов, столов, стеллажей для чистого и инфицированного материала. Покрытие лабораторной мебели, поверх­ности пола, стен и потолка должны быть гладкими и устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств.

«Чистая» зона включает гардероб для верхней одежды, комнаты отдыха, комнату для работы с документацией, комнату для надевания рабочей одежды, подсобные помещения, душевую, туалет, помещения для предварительных работ (препараторская, моечная, комната приготов­ления и разлива питательных сред и др.), стерилизационную, помещения с холодильниками для хранения питательных сред и диагностических препаратов. В «чистой» зоне возможна работа с неживыми ПБА (серологические и биохимические исследования).

Требования к проведению работ в микробиологической лаборатории

Работу с ПБА групп III и IV выполняют специалисты с высшим и средним специальным образованием. К ней допускают сотрудников, прошедших инструктаж по соблюдению требований безопасности работы с ПБА; последующий инструктаж следует проводить не реже одного разав год. Все сотрудники, работающие с ПБА, должны находиться на диспансерном учёте. Приборы, оборудование и средства измерения должны быть аттестованы, технически исправны и иметь технический паспорт. Их метрологический контроль и техническое освидетельствование следует проводить в установленные сроки.

Из правил работы в «грязной зоне» базовой лаборатории:

Использование спецодежды и средств индивидуальной защиты. Перед работой следует проверить качество посуды, пипеток, шприцев и другого оборудования. При пипетировании необходимо пользоваться только резиновыми грушами или автоматическими устройства­ми. Строго запрещено пипетировать материал ртом, переливать его через край сосуда (про­бирки, колбы), а также оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любых работ с ПБА. В грязной зоне запрещается курить, пить воду, хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, пищевые продукты. В помещения зоны нельзя приводить детей и домашних животных.

После окончания работы все объекты, содержащие ПБА, должны быть убраны в хранилища (холодильники, термостаты, шкафы) с обязательной дезинфекцией столов. Использованные пипетки полностью (вертикально) погружают в дезинфицирующий раствор, избегая образо­вания пузырьков в каналах. Остатки ПБА, использованную посуду и оборудование собирают в закрывающиеся ёмкости и передают в автоклавную. Категорически запрещено сливать отходы с ПБА в канализацию без предварительного обеззараживания. После окончания ра­боты с ПБА и заражёнными животными, а также после ухода из лаборатории следует тща­тельно вымыть руки.

ПРИНЦИПЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Цель микробиологических исследований — установить факт наличия или отсутствия возбудителя в организме больного и на объектах окружающей среды.

Задачи микробиологических исследований — идентифицировать микроорганизмы в ис­следуемом материале, определить их видовую принадлежность, морфологические, биохимические, токсигенные и антигенные свойства, а также установить чувствительность выделенных микроорга­низмов к антимикробным препаратам. Несмотря на то, что проведение микробиологических исследо­ваний относится к компетенции микробиологов, каждый врач, имеющий дело с инфекционными заболеваниями, должен знать, как и когда необходимо отбирать материал для исследований, на какие исследования его направлять и как интерпретировать полученные результаты.

Первый этап любого микробиологического исследования составляет правильный выбор материала для исследования. Его определяют свойства возбудителя и патогенез вызываемого им заболевания. При поражениях отдельных органов и систем целесообразно отбирать материал соответст­вующей локализации. При отсутствии поражений исследуют кровь, а затем отбирают образцы с учётом клинической картины заболевания и доступности материала для исследования. Так, при лихорадке неясного генеза первоначально проводят посев крови; затем, при появлении симптомов более конкретных проявлений, например пневмонии, проводят забор мокроты.

• Образцы следует забирать до назначения антимикробной терапии, с соблюдением правил асептики для предупреждения загрязнения материала. Каждый образец следует рассматривать как потенциально опасный. При заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности. Материал собирают в объёме достаточном для всего комплекса исследований. Микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в лабораторию.

• Выбор материала для исследования должен соответствовать характеру инфекционного процесса. Так, например, при установлении этиологии пневмонии материалом должна быть мок­рота, а не слюна, а при раневых инфекциях отделяемое следует забирать из глубины раны, а не с её поверхности.

Выбор лабораторных исследований

Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроско­пические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы.

Микроскопические методы

Микроскопические методы включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носит ориенти­ ровочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как мно­гие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудите­лей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.

Микробиологические методы

Микробиологические методы — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт нали­ чия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроор­ганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимичес­ких, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.

Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследу­емом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содер­жании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуе­мым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена, либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболева­ния и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведе­ния биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внут­ривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У живот­ных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели — кровь, кусочки раз­личных органон, СМЖ, экссудат из различных полостей.


Серологические методы выявления специфических АТ и Аг возбудителя – важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможности. При этом необходимо выявить повышение титров АТ, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). АТ обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов lg чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Аг многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена) с развитием реакции ГЗТ. Кожные пробы нашли применение в дианостике таких заболеваний как сап, мелиодиоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту. Используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ

Любое бактериологическое исследование начинается с микроскопии материала и его последующего посева на питательные среды. Эффективность выделения возбудителя в значительной степени обусловлена правильной техникой отбора образцов клинического материала, своевре­менностью их доставки в лабораторию и правильным хранением образцов.

Для световой микроскопии применяют микроскоп — оптический прибор, позволяющий наблюдать мелкие объекты (рис. 1-1). Увеличение изображения достигают системой линз конденсора, объектива и окуляра. Конденсор, расположенный между источником света и изучаемым объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создаёт изображение поля микроскопа внутри тубуса. Окуляр увеличивает это изображение и делает возможным его восприятие глазом. Предел разрешения микроскопа (минимальное расстояние, на кото­ром различимы два объекта) определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теорети­чески возможный предел разрешения светового микроскопа равен 0,2 мкм; реальное разреше­ние можно повысить за счёт увеличения апертуры оптической системы, например путём уве­личения коэффициента преломления. Коэффициент преломления (иммерсии) жидких сред больше коэффициента преломления воздуха («=1,0), при микроскопировании применяют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую, водную. Механическая часть мик­роскопа включает штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель.

Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для этого используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Перед началом работы свет устанавливают и центрируют по светлому полю, затем светлопольный конденсор удаляют и заменяют соответствующей системой (например, ОИ-10 или ОИ-21). Пре­парат готовят по методу «раздавленной капли», делая его как можно более тонким (толщина покровного стекла не должна быть толще 1 мм). Наблюдаемый объект выглядит как освещен­ный на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроско­па поступают только рассеянные лучи (рис. 1-2). В качестве иммерсионной жидкости пригод­но вазелиновое масло.

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объек­ты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашенные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашен­ные — фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображе­ния в фазово-контрастной (рис. 1-3) и интерференционной микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством; объективы заменяют на иммерсион­ные объективы-апохроматы.

Поляризационная микроскопия позволяет получать изображения неокрашенных ани­зотропных структур (например, коллагеновых волокон, миофибрилл или клеток микроорганиз­мов). Принцип метода основан на изучении объекта в свете, образованном двумя лучами, поля­ризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях.

Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляри­зационной микроскопии. Метод применяют для получения контрастного трёхмерного изображе­ния неокрашенных объектов. Принцип метода основан на раздвоении светового потока в микро­скопе; один луч проходит через объект, другой — мимо него. Оба луча соединяются в окуляре и интерферируют между собой.

Люминесцентная микроскопия . Метод основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 1-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.)используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокогодавления) проходит через два фильтра. Первый ( синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT или лектинов, помеченных флюорохромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг изучаемого объекта. Варианты I иммунофлюоресцентных реакций представлены рис. 1-5 и 1-6.

Рис. 1-3. Схема фазово-контрастного

Теоретически разрешение просвечивающего элек­тронного микроскопа составляет 0,002 нм; реальное, разрешение современных микроскопов приближает­ся к 0,1 нм. На практике разрешение для биологических объектов достигает 2 нм.

Просвечивающий электронный микроскоп

(рис. 1-7) состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны наблюдают на флюоресцирующем экране и регистриру­ют при помощи фотопластинки.

Сканирующий электронный микроскоп применяют для получения трёхмерного изоб­ражения поверхности исследуемого объекта.

Подготовка материала к микроскопии

В бактериологической практике микроскопически исследуют неокрашенные образцы (нативный материал) и окрашенные препараты (мазки или мазки-отпечатки), приготовленные из кли­нического материала или колоний выросших микроорганизмов.

Нативные препараты готовят для исследования живых неокрашенных бактерий. Наиболь­шее распространение получили метод висячей капли, микрокамеры с плотными сре­дами и негативные методы исследования живых бактерий. Для прижизненного ис­следования также часто применяются исследование в тёмном поле и фазово-контрас тная микроскопия. Подобные приёмы часто используют для диагностики сифилиса и предварительной диагностики диарей, вызванных кампилобактерами, а также для определе­ния подвижности микроорганизмов.

Для приготовления окрашенных препаратов из исследуемого объекта готовят мазки и фиксируют их.

Отбор материала. Тампоны, содержащие микроорганизмы, прокатывают по предметному стеклу (рис. 1-8, А); с их помощью также готовят мазки из непрозрачных жидкостей, например взвеси испражнений (рис. 1-8, Б). Мазки из материалов со слизистой или грубой консистенцией готовят растиранием их между двумя предметными стёклами (рис. 1-9). Прозрачные жидкости (например, мочу или СМЖ) можно нанести в виде капли на предметное стекло (рис. 1-10, А), при этом границы капли желательно обвести маркёром. Лучшие результаты даёт предварительное центрифугирование; затем осадок наносят на стекло; если он густой, его можно распределить с помощью стеклянной па­лочки (рис. 1-10, Б).

Фиксация. В практической бактериологии наиболее распро­странена термическая фиксация (над пламенем горелки) — метод грубый, но сохраняющий морфологию и отношение к кра­сителям у бактерий. Для более детального изучения структуры клеток применяют фиксирующие растворы, предотвращаю­щие ферментативный аутолиз бактерий и стабилизирующие мак­ромолекулы путём химического их сшивания. Для светооптической микроскопии используют формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнуа, ацетон, пары осмиевой кислоты и др. Мазки фиксируют, помещая их в раствор фиксатора или нано­ся фиксаж на мазок. Для электронной микроскопии применяют глутаральдегид и тетраоксид осмия.

Окрашивание. Стандартные красители, используемые для окраски бактерий, — карболовый фуксин Циля, фуксин Пфайф-фера и метиленовый синий по Лёффлеру. Для получения болееинформативных результатов в светооптической микроскопии используют специальные и дифференцирующие методы окраски.

Специальные методы окраски бактерий. Наибольшее распространение нашли методы Грама и Циля-Нильсена (рис. 1-11).

Дифференцирующие методы обычно применяют для окрашивания различных морфологических структур.

Капсулы. Для окраски капсул бактерий применяют методы Хисса, Лейфсона и Антони; последний метод наиболее прост и включает окраску кристаллическим фиолетовым с последующей обработкой 20% водным раствором CuSO4 .

Жгутики. Для окраски жгутиков предложены методы Лёффлера, Бейли, Грея и др. Для этих методов характерны первоначальное протравливание препарата [обычно растворами таннина, KAl(SO4 )2 , HgCl2 ] и последующая окраска (чаще карболовый фуксин Циля).

Споры. Окраску спор бактерий проводят после предварительной обработки их стенок. Наиболее прост метод Пешкова, включающий кипячение мазка с синькой Лёффлера на предметном стекле с последующей докраской нейтральным красным. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в розовый.

Питательные среды для культивирования бактерий

Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не растущие in vitro вне клеточных культур. Используемая среда должна содержать


вещества, утилизируемые бактериями для различных биосинтетических процессов.

Универсальные источники азота и углерода — бел- ковые гидролизаты (содержат полный набор аминокис- лот), пептиды и пептоны. Универсальные источники
витаминов и микроэлементов — экстракты белков жи-
вотного или растительного происхождения и белковые гидролизаты.

рН среды. В некоторых случаях жизнедеятельность
бактерий сопровождается сдвигом рН в кислую или
щелочную сторону, что требует внесения в среды раз-­
личных буферных систем (обычно применяют фосфат­-
ный буфер). Сбалансированные среды отличают высо­-
кая буферность и стабильный оптимум рН. Важно так­
же создание оптимальной концентрации О2 и СО2 . ;

Среды классифицируют по консистенции, составу, про­исхождению, назначению и загрязнённости материала.

По консистенции питательные среды разделяют на плотные (твёрдые), полужидкие и жидкие.

По составу выделяют белковые, безбелковые и ми­ неральные среды.

По происхождению среды разделяют на искусствен­ные и естественные (природные).

Искусственные среды разделяют на животные [например, мясопептонный агар (МПА) или мясопептонный бульон (МПБ)] и растительные (например, настои сена и соломы, отвары злаков, дрожжей или фруктов, пивное сусло и др.).

Естественные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворот­ка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортиров­ки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культиви­ рования (универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентифи­кации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

По загрязнённости материала . Если материал слабо загрязнён посторонней микрофлорой, то для выделения чистых культур применяют простые (по составу) среды. При обильной контами­нации сапрофитами используют специальные или элективные (для отдельных видов), селек­ тивные (только для отдельных бактерий), дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации) среды.

Консервирующие среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), гипертонический ра­створ, глицериновый консервант с LiCl2 , раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия (среда Бенгсанга-Эллиота).

Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолятная среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания усло­вий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества — соли жёлчных кислот, тетратионат Na + , теллурит К + , антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, брилли­антовый зелёный и др.

Элективные и селективные среды (например, среды Уйлсона-Блэра, Эндо, Плбскирева, Мак-Конки) предназначены для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры. Среды готовят с учётом биохимических и энергетических потребностей микроорганизмов. Соответственно, выделяют кровяные и сывороточные среды (например, Лёффлера, Бордё-Жангу), яичные среды (например, Лёвенштайна-Йенсена) и др

Дифференциально-диагностические среды (например, среды Хисса, Кларка) применяют для изучения и идентификации отдельных типов, видов и групп бактерий. В качестве основы применяют различные органические и неорганические соединения, гидролизаты казеина, пептонную воду, бульон Хоттингера-Мартена, дополненные углеводами, спиртами, мочевиной и другими веществами; при их расщеплении происходит сдвиг рН в кислую (углеводы, спирты, липилы) или щелочную (белки) сторону. Соответственно, выделяют среды с углеводами и спир­ тами, среды с мочевиной, среды для определения индолообразования, среды для определения протеолитической активности и комбинированные (политропные) среды. В такие среды так­же часто вносят различные индикаторы (например, бромтимоловый синий, индикатор Андраде, бромкрезоловый пурпурный и крезоловый красный), помогающие визуально определить изме­нение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андраде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании реактив Андраде и индикатор бром- тимоловый синий не меняют цвет среды. Все дифференциально-диагностические среды разде­ляют на четыре основные группы.

Среды, содержащие белки, дающие характерные изменения под действием бактериальных ферментов (кровь, желатина, молоко и др.), применяют для определения гемолитических или протеолитических свойств. Наиболее распространены мясопептонная желатина (МПЖ), свер­нувшаяся лошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

Среды, содержащие углеводы или многоатомные спирты. Ферментативное расщепле­ние субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды, а иногда и образованию газа. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бром-тимоловым синим, индикатором ВР), лакмусовое молоко (среда Минкевича) и среды Хисса. Из углеводов наиболее часто используют моносахариды (ксилозу, арабинозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу), дисахариды (лактозу, мальтозу, сахарозу), полисахари­ ды (крахмал, гликоген, инулин, декстрин), спирты (дульцит, маннит, сорбит, глицерин) и гликозиды (адонит, инозит, салицин, амигдалин).

Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с крас­ками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтраль­ный красный, индигокармин), а также среды с нитратами для определения денитрифицирую­щей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет).

Среды, включающие вещества, ассимилируемые только определённой группой бактерий. Наиболее известны цитратный агар Симмонса и цитратная среда Козера.

Посев и культивирование

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные пита­тельные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.). Для выделения прихотливых видов в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а также погло­ тители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, дре­весный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.

Получение изолированных колоний

Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифика­цию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, как показано на рис. 1-12, обжигая петлю после засева каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их. Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи (техникаштрихового засева показана на рис. 1-13). Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур, оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).

Состав газовой среды

Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культиви­рования.

Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факуль­тативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практи­ке их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмо­сфере снижается содержание кислорода и повышается содержание СО2 .

Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэ­робные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вейнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэроб­ных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислоро­да) — рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80 °С (для унич­тожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем про­водят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вейнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пи­петкой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены систе­мами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, переме­шивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следователь­но, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно под­держивать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пре­бывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различ­ных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбу­дителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на раз­личных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёр­дых средах бактерии формируют колонииизолированные структуры, образующиеся в ре зультате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размноже­ния одной или нескольких клеток. Таким образом, пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных сре­дах имеет больше характерных особенностей.

Некоторые бактерии выделяют гемолизины — вещества, разрушающие эритроциты. На КА их колонии окружают зоны просветления. Образование гемолизинов (и соответственно — раз­меры зон гемолиза) может быть вариабельным, и для адекватного определения гемолитической активности следует просматривать чашки с посевами против источника света (рис. 1-14). Активность гемолизинов может проявляться в полном или неполном разрушении эритроцитов.

α-Гемолиз. Разрушение эритроцитов может быть неполным, с сохранением клеточной стромы. Подобный феномен называют α-гемолиз. Просветление среды вокруг колоний обычно незначительно, позднее среда вокруг колоний может приобретать зеленоватую окраску. Подобный рост характерен для пневмококка, а также для группы так называемых зеленя­щих стрептококков.

β-Гемолиз. Гораздо большая группа бактерий вызывает полное разрушение эритроцитов, или β-гемолиз. Их колонии окружены прозрачными зонами различного размера. Например, Streptococcus pyogenes и Staphylococcus aureus образуют большие зоны гемолиза, aListeria monocytogenes или Streptococcus agalactiae — небольшие, диффузные зоны. Для определения гемолитической активности не следует применять шоколадный агар (ША), так как образующи­еся зоны α- или β-гемолиза не имеют характерных особенностей и вызывают одинаковое позеленение среды.

Размеры и форма колоний

Важные признаки колоний — их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний — признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.

В большинстве случаев ко­лонии грамположительных бактерий мель­че колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавлен­ный или приподнятый центр. Другой важный признак — форма краёв колоний. При изучении фор­мы колоний учитывают характер её поверх­ности: матовый, блестящий, гладкий или ше­роховатый. Края колоний могут быть ров­ными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы ко­лоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны как диссоциации. Наиболее часто обнаруживают S — и R duc социации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R-колонии — неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.

При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже — красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги [от греч. iris , радуга]. Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специ­альных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, ко­лонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы. В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.

Консистенция колоний и особенности роста на среде

Полезную информацию могут дать консистенция колоний и особенности роста на среде. Обычно эту информацию можно получить при прикосновении к колониям петлёй. Колонии могут легко сниматься со среды, врастать в неё или вызывать её коррозию (образуя трещины и неровности). Консистенция колоний может быть твёрдой или мягкой.Мягкие колонии — маслянистые или сливкообразные; могут быть слизистыми (прилипают кпетле) или низкими (тянущимися за петлёй).

Твёрдые колонии — сухие, восковидные, волокнистые или крошковатые; могут быть хрупкими и ломаться при прикосновении петлёй.

Запах — менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носятсубъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели,культуры листерий — молочной сыворотки, протеев — гнилостный запах, нокардий — свежевскопанной земли.

Биохимические методы идентификации бактерий

Методов, используемых для идентификации особенностей метаболизма бактерий, очень много, но на практике применяют небольшое их количество. Большинство способов основано на использовании дифференциально-диагностических сред, включающих различные индикаторы.

Способность к ферментации углеводов

Способность к ферментации углеводов оценивают по изменению окраски среды вследствие образования органических кислот (соответственно, происходит уменьшение рН), вызывающихизменение окраски индикатора.

«Пёстрый» ряд. Для определения сахаролитической активности применяют среды Хисса; в их состав входят 1% пептонная вода (или МПБ), индикатор Андраде и один из углеводов. При расщеплении углевода происходит изменение цвета среды с жёлтого на красный. Поскольку бактерии различают по способности ферментировать те или иные углеводы, то ряды пробирок приобретают пёстрый вид. Поэтому этот набор сред и называют «пёстрый» (или цветной) ряд.


Стеклянные поплавки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать уг­леводы с образованием кислоты и газа в сосуды со средами вносят стеклянные поплавки (запаянные с одного конца короткие трубочки), всплывающие после наполнения их газом.

Некоторые бактерии проявляют протеолитическую активность, выделяя протеазы, катализи­рующие расщепление белков. Наличие протеолитических ферментов из группы коллагеназ оп­ределяют при посеве уколом в МПЖ. При положительном результате наблюдают его разжиже­ние в виде воронки либо послойно сверху вниз. Способность к расщеплению белков и амино­кислот также можно оценивать по изменению окраски среды, так как образующиеся продукты — аммиак, индол и сероводород — сдвигают рН в щелочную сторону, вызывая изменение окраски индикатора.

Образование аммиака. Для определения способности к образованию NH3 проводят посев в МПБ, и между его поверхностью и пробкой закрепляют полоску лакмусовой бумаги. При положительном результате бумажка синеет.

Образование индола и H 2 S . Обычно для определения способности к образованию индола и сероводорода также проводят посев в МПБ, между его поверхностью и пробкой закрепляют бумажки: в первом случае пропитанные раствором щавелевой кислоты <при образовании индола бумажка краснеет), во втором — раствором ацетата свинца (при образовании H 2 S бумажка чернеет). Также используют специальные среды, содержащие индикаторы (напри­мер, среда Клиглера), либо их вносят непосредственно в среду после регистрации видимого роста бактерий.

Тест на нитратредуктазную активность

Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет опреде­лить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Способность к восстановлению NO3 в N02 , определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO3 . Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса. При положительном резуль­ тате наблюдают появление красного кольца .

Хроматографические методы используют для идентификации бактерий и установления их систематического положения. Объекты для исследования — жирные кислоты клеточной стенки, уникальные интермедиаты и конечные метаболиты жизнедеятельности бактерий. Хроматографические системы обычно сопрягают с компьютерами, что значительно упрощает учёт результатов. Наиболее распространена идентификация жирных короткоцепочечных и тейхоевых кислот методом газожидкостной хроматографии. Жидкостной хроматографией под высоким давлением идентифицируют миколевую кислоту в клеточных стенках микобактерий. Тонкослойную хроматографию используют для идентификации изопреноидных хинонов клеточной стенки бактерий. У различных родов их содержание и набор различны, но постоянны, что позволяет установить систематическое положение каждого конкретного вида.

Для изучения биохимической активности бактерий широко применяют системы индикаторных бумажек или наборы мультимикротестов.

Система индикаторных бумажек (СИБ) — набор дисков, пропитанных различными субстратами. Их можно непосредственно вносить в пробирки со взвесью бактерий либо предварительно поместить в лунки пластиковых планшетов, куда будут внесены исследуемыебактерии. Так, на практике применяют наборы MinitekEnterobacteriaceaelll и MinitekNeisseria для дифференциальной диагностики энтеробактерий (четырнадцать субстратов) инейссерий (четыре субстрата), позволяющие получить результаты через 4 ч инкубации при37 0 С.

Наборы мультимикротестов — пластиковые планшеты, в лунки которых помещены различные субстраты и индикаторы. В лунки вносят различные разведения бактерий и инкубируютпри 37 °С. На практике используют тесты RapIDNH для идентификации нейссерий и гемофилов, RapID Е для энтеробактерий и др., позволяющие получить результаты не позднее 4-8 ч.

Автоматические системы идентификации бактерий

Автоматические системы идентификации бактерий позволяют быстро (на 24-48 ч быстрееобычных методов) получить информацию о виде возбудителя заболевания и его чувствительности к антимикробным препаратам. В настоящее время наибольшее распространение получилисистемы типа Microscan и Vitek.

Системы Microscan . Используют турбидиметрические, колориметрические и флюоресцентныеметоды идентификации бактерий. Системы состоят из комплектов пластиковых планшетов,содержащих различные субстраты. Грамположительные и грамотрицательные бактерии дифференцируют с помощью флюоресцирующих субстратов (время анализа — 2 ч). Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей используют хромогенные субстраты, изменяющие своюокраску (время анализа — 4-6 ч). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков определяют по изменению оптической плотности. Система компьютеризирована иавтоматически проводит все необходимые расчёты.
Системы Vitek . В этой системе применяют один тип планшетов с тридцатью лунками.В каждую лунку автоматически вносится суспензия бактерий с известной концентрацией микробных тел. Идентификация микроорганизмов (гемофилы, нейссерии, дрожжи и анаэробы) основана на турбидометрии реакционной среды в лунке. В зависимости от свойств микроорганизма время, необходимое для его идентификации, варьирует от 4-8 до 18 ч. Системаполностью компьютеризирована и работает автоматически.

Методы идентификации нуклеиновых кислот

Методы выявления РНК и ДНК возбудителей нашли применение в основном при диагностике вирусных инфекций. Тем не менее разработаны тест-системы для идентификации некоторых прихотливых бактерий (например, легионелл, хламидий), а также для идентификации колоний Neisseha gonorrhoeae , Haemophilus influenzae типа b, стрептококков группы В, энтерококков и микобактерий.

Гибридизация нуклеиновых кислот

Наиболее распространены методы гибридизации нуклеиновых кислот (рис. 1-17). Принцип методов обусловлен способностью ДНК (и РНК) специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами искусственно созданных нитей ДНК (и РНК), меченных изотопами или ферментами (пероксидазой или щелочной фосфатазой). В дальнейшем образцы исследуют различными методами (например, ИФА).

Метод гибридизации в растворах даёт наиболее быстрые результаты (рис. 1-18, А). Ши­рокому внедрению метода препятствует проблема удаления не связавшихся нитей нуклеино­вых кислот.

Метод гибридизации на твёрдой основе (рис. 1-18, Б) и его сэндвич- модификация (рис. 1-18, В) распространён больше. В качестве твёрдой основы служат мембраны из нитроцеллюлозы или нейлона. Не связавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

Основу метода ПЦР составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. Первоначально проводят отжиг — термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Затем среду охлаждают и вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции применяют синтетические праймеры — олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеоти-дов (например, дезоксинуклеотидтрифосфат), взаимодействующие с окончаниями последо­вательностей и образующие последовательности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят тер­мостабильную taq-полимеразу (по названию бактерии Thermus aquaticus ), что запускает образова­ние вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК сноваподогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; поскольку tag-полимераза термостабильна, то необходимость в её повторном внесении отсутствует (рис. 1-19). ПЦР позволяет получить большие количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза. Метод ПЦР лежит также в основе ДНК-идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и пр.

Классические серологические реакции применяют для выявления бактериаль­ных AT, а также для выявления Аг, особенно для идентификации бактериальных Аг. Среди современных методов наибольшее распространение нашли методы твердофазного ИФА и ла­текс-агглютинации.

Сенсибилизирующей активностью обладает ограниченное количество бактериальных Аг. Поэтому метод кожных проб применяют лишь при диагностике туберкулёза, сапа, мелиоидоза, бруцеллёза и туляремии.

Выделение патогенных бактерий от заражённых животных имеет большую диагностическую ценность, особенно при контрольном применении иммунных сывороток. Цель подобных мани­пуляций — уменьшение времени проведения бактериологических исследований.

• При диагностике инфекций, вызванных эффектами токсина (например, ботулизма или сибирской язвы), материал, предположительно содержащий возбудитель и токсин, помещают в физиологический раствор, а затем фильтруют через бумажные фильтры, натёртые тальком (последний хорошо адсорбирует токсин). Смывами с фильтров заражают чувствительных животных.

• При диагностике инфекций, обусловленных различными патогенными свойствами самого возбудителя, лабораторных животных заражают микробной взвесью.

• Для диагностики бактериальных инфекций используют различных животных, так как проявляют видовую восприимчивость к различным этиологическим агентам.

Мыши чувствительны к пневмококкам, нейссериям, пастереллам, клостридиям, листериям, возудителям сибирской язвы, туляремии, чумы, ботулизма, столбняка, коклюша и мелиоидоза

Крысы чувствительны к возбудителям туберкулёза (бычьего типа), мелиоидоза и др.

Морские свинки чувствительны к возбудителям туберкулёза (человеческого типа), дифтерии, сапа, чумы, бруцеллёза, туляремии, холеры, газовой гангрены, ботулизма, псевдотуберкулёза и др.

Кролики чувствительны к стафилококкам, стрептококкам, нейссериям, Mycobacterium bovis , возбудителям газовой гангрены, сибирской язвы, ботулизма, столбняка и др.

Кошки. Животных заражают стафилококками, возбудителями сапа, коклюша и др.

Обезьяны. Их заражают шигеллами, листериями, сальмонеллами, возбудителями мелиоидоза,коклюша и др.

Птицы. Кур и голубей используют для диагностики туберкулёза (птичьего типа), пастереллёза, риносклеромы и др.

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСОВ

Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций включают:

• выделение и идентификацию возбудителя;

• обнаружение и определение титров противовирусных AT;

• обнаружение Аг вирусов в образцах исследуемого материала;

• микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

Забор материала. При заборе материала для исследований необходимо выполнять следую­щие условия:

• образцы следует отбирать как можно раньше либо с учётом ритма циркуляции возбудителя;

• материал следует отбирать в объёме, достаточном для всего комплекса исследований;

• образцы следует доставлять в лабораторию незамедлительно (!), при относительно кратковре­менной транспортировке (не более 5 сут) образцы сохраняют на льду, при более длитель­ной — при температуре -50 °С.

Выделение и культивирование вирусов

Выделение и идентификация возбудителя — «золотой стандарт» в диагностике вирусных инфекций.

Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток — один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каж­дому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвест­ного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соот­ветствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и живот­ных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плос­кую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.

Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизиро­ванием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.

Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и живот­ных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтан­ной трансформации.

Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подверг­нутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравне­нию с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.

Не все виды клеток способны расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживаю­щей ткани.

Куриные эмбрионы (рис. 1-20) — практически идеальные модели для культивирования не­которых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проник­новению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирова­ния и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбу­дители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распозна­вать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.

Заражение на хорион-аллантоисную мембрану. Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобож­дают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают от­верстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, сво­бодный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обрабо­танный бактерицидами).

Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.

Заражение в аллантоисную по­ лость. 10-суточные эмбрионы зара­жают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).

Заражение в желточный мешок. Используют 3

8-суточные эмбрио­ны, у которых в этом возрасте жел­точный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воз­душном мешке

Наблюдение и учёт результатов. В качестве вируссодержащего материала можно исполь­зовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими

тканями на кусочки. Для выявления Рис. 1-20.Схематическое изображение

характер­ных поражений на хорион- развивающегося куриного эмбриона.

аллантоисной мембране удаляют скорлупу

и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.

При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили кле­точные культуры. Тем не менее, животные модели активно используют для изучения особенно­стей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.

Наличие и биологическую активность вирусов определяют по эффектам, наблюдаемым на животных моделях (повышение температуры тела, появление характерных клинических при­знаков, гибель и т.д.), куриных эмбрионах и на клетках (в культурах). Под воздействием конкретных вирусов возможно изменение морфологии, роста, репродукции клеток либо их разрушение. Факт размножения вирусов в чувствительных клетках in vitro определяют по цитопатическим эффектам (в том числе бляшкообразованию, тельцам включений), феномену гемадсорбции, «цветной реакции».

Цитопатические эффекты оценивают при микроскопии клеточных культур. По степени поражения клеток выделяют вирусы с высокой или умеренной цитопатогенностью. Размноже­ние вирусов в культурах клеток сопровождается нарушениями морфологии клеток монослоя. Некоторые вирусы вызывают характерные цитопатические изменения, что (с учётом клиничес­кой картины заболевания) позволяет быстро поставить предварительный диагноз. Например, размножение парамиксовирусов (вирусы кори, паротита, PC-вирус) сопровождается появлени­ем характерных гигантских многоядерных клеток; аденовирусы вызывают образование скопле­ний больших круглых клеток, а при репродукции герпесвирусов клетки округлой формы диффузно располагаются по всему монослою.

Бляшкообразование. «Бляшками» называют негативные колонии — участки разрушенных клеток, выглядящие как зоны просветления на монослоях клеток, покрытых слоем агара. В некоторых случаях дозу и цитопатогенность вируса выражают в бляшкообразующих едини­цах (БОЕ).

Тельца включений. Многие вирусы вызывают появление в заражённых клетках характерных образований — скоплений вирусных белков или частиц, видимых в световой микроскоп. Тельца включений могут располагаться как в цитоплазме (тельца Гварнери при оспе), так и в ядрах клеток (аденовирусы).

Отсутствие цитопатического эффекта. Некоторые вирусы (например, вирус краснухи) не проявляют цитопатического эффекта. Их можно выявлять по интерференции другого вируса, способного вызывать дегенерацию заражённых клеток.

Феномен гемадсорбции. Многие заражённые вирусами клетки приобретают способность сорбировать на своей поверхности различные эритроциты. Феномен гемадсорбции имеет общие механизмы с гемагглютинацией и проявляется на ранних сроках, до проявления цитопатическо­го эффекта, при его отсутствии либо слабой выраженности.

«Цветная реакция». В культуральную среду, используемую для поддержания клеток, вно­сят индикатор. Рост клеток сопровождается накоплением метаболитов, сдвигом рН среды и изменением окраски индикатора. Заражение культур вирусом резко ингибирует клеточный ме­таболизм, и среда сохраняет первоначальный цвет.

Экспресс-диагностика. Для быстрой идентификации вирусной инфекции разработаны мно­гочисленные методы экспресс-диагностики, основанные на обнаружении вирусных Аг. Например, для раннейдиагностики ВИЧ-инфекции широко используют ИФА, выявляющий поверхностные Ar вируса.

Количественное определение вирусов проводят двумя путями — изучением инфекционности и количественным определением вирусных Аг. Определение титра инфекционности вирусов в значительной степени зависит от метода количественного исследования; у бактериофагов отно­шение инфекционность-частица составляет приблизительно 1 (то есть каждая вирусная час­тица способна вызвать инфекцию), для вирусов животных данное отношение составляет 1:10 (иногда выше из-за вирусингибирующего действия факторов резистентности).

Определение инфекционности вирусов. Наиболее доступная форма количественного определения — подсчёт числа вирусных «бляшек». Прямые тесты на инфекционность применя­ют для установления инфекционной дозы (ID) или летальной дозы (LD) изучаемого вируса (обычно выражают в lg ). ID50разведение, инфицирующее 50% клеток; LD50разведение, убивающее 50% поражённых клеток или животных.

Выявление вирусных Аг и вирусных частиц. Наиболее распространённый метод — реакция количественной гемагглютинации. Метод основан на способности вирусов сорбиро­ваться на поверхности эритроцитов животных и человека. Количественную электронную мик­роскопию применяют для подсчёта общего числа вирусных (но не инфекционных) частиц в исследуемом обьекте (например, культуральной жидкости).

Изучение морфологии вирусов возможно лишь при помощи электронной микроскопии, одна­ко чаще всего этот метод недоступен из-за отсутствия столь дорогого и сложного прибора. Более того, многие возбудители морфологически сходны, что снижает ценность этого метода. Наиболее распространён метод микроскопии содержимого везикул и тканевых экстрактов, об­работанных красителями (негативное контрастирование), с последующим подсчётом ДНК- или РHK-содержащих вирусов. Электронная микроскопия позволяет быстро обнаружить орто- и парамиксовирусы в отделяемом дыхательных путей, герпесвирусы в жидкости везикул и ротавирусы в фекалиях.

Серологические методы идентификации

При большинстве вирусных инфекций развиваются иммунные реакции, применяемые для диагностики. Клеточные реакции обычно оценивают в тестах цитотоксичности лимфоцитов в отношении инфекционных агентов или заражённых ими клеток-мишеней либо определяют спо­собность лимфоцитов отвечать на различные Аг и митогены. В работе практических лаборато­рий выраженность клеточных реакций определяют редко. Большее распространение нашли ме­тоды идентификации противовирусных AT.

РН основана на подавлении цитопатогенного эффекта после смешивания вируса со специфичными AT. Неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток указывает на несоответствие инфекционного агента и известных AT .

Торможение гемагглютинации. РТГА применяют для идентификации вирусов, способ­ных агглютинировать различные эритроциты. Для этого смешивают культуральную среду, со­держащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию тор­можения цитопатического эффекта за счёт интерференции вирусов применяют для идентифи­кации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чув­ствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым AT.

Прямая иммунофлюоресценция. Среди прочих тестов наибольшее распространение нашла реакция прямой иммунофлюоресценции (наиболее быстрая, чувствительная и воспроизводимая). Например, идентификация ЦМВ по цитопатогенному эффекту требует не менее 2-3 нед, а при использовании меченых моноклональных AT идентификация возможна уже через 24 ч. Имея набор подобных реагентов, их можно вносить в культуры, заражённые вирусом, инкубировать, отмывать не связавшийся реагент и исследовать с помощью люминесцентной микроскопии (по­зволяет выявить наличие флюоресценции заражённых клеток).

Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифи­цировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различ­ные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенно­стях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами AT, но сложность и дороговизна метода ограничивают его применение.


Выявление противовирусных AT в сыворотке

Более простой и доступный подход — выявление противовирусных AT в сыворотке. Образцы крови необходимо отбирать дважды: немедленно после появления клинических признаков и через 2-3 нед. Чрезвычайно важно исследовать именно два образца сыворотки. Результаты однократного исследования нельзя считать окончательными из-за невозможности связать появ­ление AT с настоящим случаем. Вполне возможно, что эти AT циркулируют после предшествую­щей инфекции. В подобной ситуации роль исследования сыворотки, полученной в период реконвалесценции, трудно переоценить. На наличие заболевания в период отбора первой пробы ука­зывает не менее чем четырёхкратное увеличение титра AT , выявленное при исследовании второй пробы.

Перечисленные ниже методы не позволяют дифференцировать AT, образующиеся во время болезни и циркулирующие после выздоровления (продолжительность этого периода вариабель­на для различных инфекций). Поскольку для адекватной диагностики необходимо подтвердить достоверное увеличение титров AT в двух пробах, то первую пробу исследуют в острой фазе, а вторую — в период выздоровления (через 2-3 нед). Полученные результаты носят ретрос­ пективный характер и более пригодны для проведения эпидемиологических обследований.

РТГА выявляет AT, синтезируемые против гемагглютининов вирусов (например, вирусагриппа). Метод позволяет легко выявлять подобные AT в сыворотке больного.

РСК — основной метод серодиагностики вирусных инфекций (среди доступных). Реакция вы­являет комплементсвязывающие IgM и IgG, но не дифференцирует их; для оптимизации получаемых результатов постановка реакции требует определённых навыков персонала.

РИФ. При возможности получить биоптат инфицированной ткани и доступности коммерческих наборов AT, меченных флюоресцеином, диагноз может подтвердить реакция прямой иммунофлюоресценции. Постановка реакции включает инкубацию исследуемой ткани с AT, их после­дующее удаление и люминесцентную микроскопию образца.

Иммуносорбционные методы (например, ИФА и РИА) более информативны, посколь­ку выявляют IgM и IgG по отдельности, что позволяет делать определённые выводы о динами­ке инфекционного процесса или состоянии реконвалесценции. Для выявления AT известный Аг сорбируют на твёрдом субстрате (например, на стенках пробирок, пластиковых микропланшетах, чашках Петри) и вносят различные разведения сыворотки пациента. После соот­ветствующей инкубации не связавшиеся AT удаляют, вносят антисыворотку к lg человека, меченную ферментом, повторяют процедуру инкубирования и отмывания несвязанных AT и вносят какой-либо хромогенный субстрат (чувствительный к действию фермента). Поскольку изменение окраски пропорционально содержанию специфических AT, то вполне возможно определение их титра спектрофотометрическим способом. В диагностике ВИЧ-инфекции наи­большее распространение нашёл метод иммуноблотинга.

Выявление вирусных Аг

ИФА. В настоящее время уже появились коммерческие наборы для выявления Аг некоторых возбудителей, позволяющие их идентифицировать в течение 5-10 мин. Для выявления Аг на твёрдой фазе сорбируют известные AT и добавляют сыворотку, содержащую Аг; после инкуби­рования несвязанный Аг декантируют, систему промывают и вносят меченые AT, специфичные к сорбированным AT. Повторяют процедуру инкубирования и отмывания, вносят хромогенный субстрат, положительный результат фиксируют при изменении окраски системы.

Гибридизация ДНК — высокоспецифичный метод, позволяющий идентифицировать геном вируса после его гибридизации комплементарными молекулами ДНК. В качестве маркёра применяют ферменты и изотопы. Метод определяет способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК; специфичность метода прямо пропорциональна длине I комплементарной цепочки. Перспективен метод гибридизации нуклеиновых кислот in situ . Д ля постановки реакции меченую ДНК наносят на биоптаты тканей (в том числе на фиксированные формалином или заключённые в парафиновые блоки) и регистрируют взаимодействие с комплементарной ДНК. Метод используют для выявления вирусов простого герпеса, папилломы человека, Эпстайна-Барр и др.

ПЦР. Метод значительно увеличивает чувствительность метода гибридизации, повышая содержание вирусной ДНК в материале, полученном от больного, а также ускоряет время получения результата.

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Микроскопия — один из основных методов выявления возбудителей микозов. Позволяетпроводить экспресс-диагностику микозов и получать результат в течение 1-2 ч, тогда как длявыделения культуры возбудителя необходимы недели. Для экспресс-диагностики препаратычасто необходимо окрашивать специальными красителями, так как простая окраска гематоксилином и эозином часто не позволяет выявить клетки грибов.

Микроскопия методом висячей или раздавленной капли. Метод позволяет выявить структуры грибов в клинических образцах без предварительного окрашивания.

Обработка 10% едким кали (КОН). Метод используют в первую очередь для визуализа­ции структур возбудителей в фрагментах кожи и её придатках (ногти, волосы), отделяемом очагов поражения и влагалища. В указанных образцах содержится большое количество клеток, в которых КОН разрушает кератин, оставляя неизменёнными клетки грибов.

Окраска по Граму. В мазках из клинического материала грибы представлены грамположительными клетками. Клетки Cryplococcus neoformans плохо воспринимают красители, что можно использовать как дифференциально-диагностический признак при микроскопии окра­шенных мазков СМЖ.

Окраска нигрозином или тушью по Бурри мазков СМЖ позволяет выявить капсулированные клетки Cryptococcus neoformans . Для идентификации этого микроорганизма можно использовать муцикармин или конго красный.

Окраска по Романовскому — Гимзе или Райту мазков крови и костного мозга позволяет вы­явить дрожжевую форму Histoplasma capsulatum в цитоплазме фагоцитов.

Окраска метенаминовым серебряным по Гомори. Метод включает предварительную обработ­ку гистологических препаратов хромовой кислотой с последующим нанесением красителя (клетки грибов тёмно-серые или чёрные).

Окраска по Гридли. Метод включает предварительную обработку препаратов хроматом лейкофуксина с последующим нанесением фуксинового альдегида и метанилового жёлтого (клетки грибов розово-пурпурные на жёлтом фоне).

Окрашивание перйодной кислотой и реактивом Шиффа (по Мак-Манусу). 1,2-Гликольные группировки полисахаридов клеточных стенок грибов сначала окисляются перйодной кис­лотой до альдегидов, реагирующих с сульфитом лейкофуксина реактива Шиффа; клетки окрашиваются в насыщенно розовый или красный цвет.

Наибольшее распространение нашла РИФ. Применяют AT, меченные флюоресцеинами; для выявления грибковых Аг реагент наносят на гистологический препарат, инкубируют и проводят люминесцентную микроскопию.

Культуральные условия и потребности роста у патогенных грибов отличаются от таковыху возбудителей бактериальных инфекций. Большинство патогенных грибов не требовательнок питательным средам и хорошо растёт в аэробных условиях. Для роста грибов среды могутвключать какой-либо органический источник углерода, неорганического азота в виде нитратов или аммонийных солей. рН питательных сред кислый (около 4,0-6,5), большинство бактерий не способно расти в подобных условиях. Среди витаминов большинство грибов нуждается в водорастворимых (например, биотине, рибофлавине, тиамине и др.). Большинство патогенных видов мезофилы и растёт в интервале температур 20-45 «С. При выделении обычно делают парные посевы, один из которых инкубируют при 25 0 С, а второй — при 37 °С; подобная манипуляция позволяет выявить возможный диморфизм. Идентификацию возбудителя проводят по морфологическим и биохимическим признакам. В практической работе обычно используют два типа сред — неселективные и селективные.

Наиболее распространён агар Сабуро — пептонный агар с мальтозой (или глюкозой). Его отличает высокое содержание углеводов, ингибирующее размножение бактерий. Также исполь­зуют МПА, картофельно-декстрозный агар, агар Чапека-Докса, дрожжевой агар, сусло-агар и др. Нередко среды модифицируют добавлением антибиотиков, циклогексимида или хлоргексидина. Для выделения прихотливых патогенов (например, Blastomyces dermatitidis и Histoplasma capsulatum ) в качестве обогащенных сред применяют 5-10% КА, дополненный сердечным и мозговым экстрактом, либо асцитический агар. После образования колоний следу­ет делать пересев на более простые среды, например картофельно-декстрозный агар или среду Сабуро, на которых можно быстрее выявить споруляцию возбудителей.

Селективные среды обычно получают на основе неселективных, с добавлением пенициллина (20 ЕД/мл), стрептомицина (40 ЕД/мл) или гентамицина (0,5 мкг/мл), левомицетина (16 мкг/мл). Для ингибирования бурного роста плесеней, подавляющих медленно растущие диморфные грибы, в среды вносят циклогексимид (0,5 мкг/мл). Следует помнить, что препарат подавляет рост неко­торых патогенных грибов (например, Cryptococcus neoformans и Aspergillus fumigatus ).

Выявление противогрибковых AT и грибковых Аг

Наиболее часто применяют реакцию латекс-агглютинации (выявляет IgM), PCK (выявляет IgG) и ИФА. Результаты реакций часто могут быть сомнительными вследствие перекрёстного реагирования с Аг различных грибов. Тем не менее идентификация AT или циркулирующих Аг в крови, СМЖ и моче позволяет установить диагноз до получения результатов посевов.

Кожные пробы ранее были одним из популярных методов диагностики микозов, однако их неспецифичность ограничивает диагностическую ценность. В настоящее время их чаще исполь­зуют для изучения иммунной прослойки в популяции при эпидемиологических исследованиях.

Гибридизация нуклеиновых кислот — новый метод идентификации патогенных гри­бов, разработанный для определения основных возбудителей системных микозов — бласто-, крипто- и кокцидиоидомикозов, а также гистоплазмоза. Для постановки реакции проводят экст­ракцию РНК из культуры и вносят одноцепочечные молекулы ДНК, меченные флюоресцеином. При наличии в культуре одного из четырёх указанных возбудителей происходит гибридизация соответствующей ДНК с РНК патогена с образованием легко обнаруживаемого комплекса. Ос­новное достоинство метода — возможность применения на ранних сроках (5 сут) в культурах, содержащих мицелиальные и дрожжевые формы.

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОСТЕЙШИХ

Выявление патогенных простейших основано на идентификации морфологических особенно­стей возбудителя и в значительной степени зависит от правильного взятия клинического мате­риала и адекватной фиксации. Ошибки при проведении этих мероприятий могут привести к получению ошибочных результатов.

Поиск патогенных простейших обычно проводят в субстратах, являющихся средой их обита­ния — испражнениях, крови.

Дли адекватного выявлении паразитов в ЖКТ необходимо исследовать не менее трёх проб, полученных в течение 10 сут. Для диагностики амебиаза этого может оказаться недостаточ­но, и при подозрении на это заболевание необходимо исследовать шесть проб, полученных в течение 14 сут. Следует избегать попадания в материал воды или мочи, губительно действу­ющих на простейших. Если больному в диагностических целях вводили внутрь сульфат ба­рия, минеральное масло, препараты висмута или проводили специфическую терапию, то за­бор испражнений следует проводить не ранее 8-х суток после последнего введения. Для выяв­ления трофозоитов (подвижных форм) жидкие испражнения необходимо исследовать в течение 30 мин после получения; при более оформленном стуле эти исследования можно провести в течение часа; на более поздних сроках трофозоиты обычно разрушаются. При невозможности своевременного обследования в образцы вносят фиксирующие растворы, сохраняющие мор­фологию взрослых особей.

Макроскопическое исследование может выявить примесь крови и слизи (частый диагнос­тический признак амебиаза). Выявление же самих паразитов проводят при светооптической микроскопии влажных нативных препаратов либо в окрашенных мазках.

Микроскопия нативных препаратов. Небольшое количество испражнений наносят на пред­метное стекло, диспергируют в капле физиологического раствора, накладывают покровное стекло и исследуют под микроскопом на наличие трофозоитов (в жидкие испражнения физио­логический раствор не вносят). Нативные препараты можно слегка докрашивать раствором Люголя, что облегчает выявление цист. Особенно внимательно необходимо исследовать кровь и слизь; желательно готовить отдельные препараты, не контаминированные (по возможнос­ти)фекальными массами.

Методы накопления. Для выявления паразитов, присутствующих в незначительных количе­ствах, применяют различные методы накопления. При исследовании кала наиболее часто используют седиментационный метод. Для исследования забирают каплю надосадочной жидкости, наносят на предметное стекло, где смешивают с равным объёмом физиологическо­го раствора, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Смесь на предметном стекле можно подкрашивать раствором Люголя, раствор разрушает трофозоиты, но позволяет хоро­шо визуализировать ядра и включения гликогена в цистах.

Микроскопия окрашеных мазков позволяет не только выявлять, но и дифференцировать простейших; окраску наиболее часто проводят гематоксилином и эозином по Хайденхайну.

Капиллярную или венозную кровь помещают в пробирку с антикоагулянтом (например, с этилендиаминтетрауксусной кислотой); исследования необходимо проводить по возможности быстро. Обнаружение простейших проводят микроскопией толстых и тонких мазков. Толстые мазки готовят из больших объёмов крови, нанесённых на предметное стекло; ихобычно окрашивают по Романовскому-Гимзе, чего обычно бывает вполне достаточно длявыявления паразитов. Тонкие мазки готовят для облегчения морфологической дифференцировки паразитов крови,мазки обычно окрашивают по Романовскому-Гимзе или Райту.

Образцы различных тканей

Образцы различных тканей отбирают, учитывая биологию паразита и его типичную локали­зацию. Образцы кожных покровов окрашивают обычными гистологическими красителями и микроскопируют. Биоптаты лимфатических узлов, селезёнки, печени, аспираты костного мозга и СМЖ забирают при подозрении на трипаносомозы или лейшманиозы. Часть образцов микро­скопируют в виде нативных мазков, часть окрашивают по Романовскому-Гимзе или Райту. Также возможно окрашивание образцов различными гистологическими красителями, наиболее употребляемыми для изготовления препаратов из исследуемых тканей.

Выделение возбудителей проводят только в специализированных лабораториях, институтах и центрах; проводить эти мероприятия в обычных бактериологических лабораториях недопус­тимо. На специальных средах и культурах тканей можно выделять и культивировать практи­чески все патогенные простейшие.

Серологические исследования — наиболее распространённые и доступные диагностические ме­тоды. Их часто проводят при подозрении на токсоплазмоз, амебиаз (РИГА, латекс-агглютинация), лейшманиозы (РИГА), трипаносомозы (РИГА, РСК) и т.д.

Подробно рассмотрев известные способы идентификации различных микроорганизмов, можно сделать вывод, что в основном это длительный и трудоемкий процесс, требующий достаточного набора знаний, оборудования и специальных условий. Но не сотря на все трудности, диагностика необходима в целях идентификации микроорганизмов при установлении диагноза инфекционных заболеваний или иных вызванных микробами процессов и определения физиологических свойств культуры с другими целями, например при выборе химиотерапевтического препарата. Но жаль, что пока не существует универсального метода для быстрого и качественного определения микроорганизма. Каждый метод подходит для определённого ряда инфекций и не годиться для определения возбудителей других заболеваний. Также мало пока способов внелабораторной диагностики, потому что, например, часто необходимо наличие чистой культуры, что практически невозможно создать в полевых условиях. В мире постоянно появляются или обнаруживаются новые неизвестные микроорганизмы и, возможно, от скорости их идентификации будет зависеть жизнь многих людей. Из всего этого можно сделать вывод, что человечеству необходимо уделять больше внимания развитию микробиологии.

Технологии

Технология микробиологического синтеза обязательно включает в себя в качестве основной стадию промышленного культивирования соответству-ющего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышленного производства такое культивирование проводят по одному из следующих двух способов:

1. Культивирование на твердых питательных средах или на поверхности тонкого слоя жидкой питательной среды (поверхностный способ выра-щивания продуцента),

2. Культивирование соответствующего продуцента в большом объеме жидкой фазы, содержащей все необходимые для нормального роста и развития микроорганизма питательные вещества (глубинный способ выращивания продуцента).

В настоящее время проведение микробиологических исследований является важной и актуальной деятельностью в биологии и медицине, так как они позволяют с высокой степенью точности и достоверности подтвердить или опровергнуть факт присутствия в организме (или другом исследуемом объекте) возбудителей инфекционных заболеваний. Классические микробиологические методы исследования решают задачи выделения чистой культуры возбудителя с его последующей идентификацией по биохимическим, антигенным и другим признакам [1]. Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроскопические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы [3]. Благодаря микробиологическим методам исследования можно установить возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний и подобрать правильный метод лечения этого заболевания. Цель: Описать основные микробиологические методы исследований, применяемых в биологии и медицине.

Микроскопический метод

Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях. Микроскопические методы исследований включают в себя приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носят ориентировочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как многие микроорганизмы лишены явных морфологических (т.е. структурных) внешних и внутренних особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудителей (например, наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить сам факт наличия или отсутствия микроорганизмов в исследуемых образцах. Существуют световая, фазово-контрастная, темнопольная (ультрамикроскопия), люминесцентная, поляризационная, ультрафиолетовая и электронная микроскопия

Микробиологический метод

Микробиологические методы исследований — «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроорганизма) проводят с учётом морфологических, культуральных, биохимических, антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает также определение чувствительности к антимикробным препаратам (например, к антибиотикам) у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров и т.д.

Биологический метод

Биологические методы исследований направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследуемом материале и на обнаружение самого возбудителя (особенно при его незначительном исходном содержании в исследуемом образце). Методы включают в себя заражение лабораторных животных исследуемым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных — важный инструмент изучения патогенеза заболевания и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведения биологических проб используют только здоровых животных определённой массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутривенно, внутримышечно, подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У животных прижизненно забирают кровь, экссудат (скопившуюся жидкость) из брюшной полости, после гибели — кровь, кусочки различных органов, экссудаты из различных полостей [3]

Серологический метод

Серологические методы исследований для выявления специфических антител и антигенов возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудителя не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров антител (т.е. их концентрации), в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). Aнтитела обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для эпидемиологических исследований. Особое значение имеют методы выявления микробных антигенов, порождающих антитела. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Аллергологический метод

Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, т.е. способны вызывать аллергические реакции. Это используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена). Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю [4].

С помощью методов, применяемых в микробиологии, люди научились выявлять и определять различного рода возбудителей тех или иных инфекционных заболеваний. Правильно выбранный метод способствует в дальнейшем правильному лечению заболеваний. В настоящее время наиболее широко используются микроскопический, микробиологический и биологический методы исследования, потому что именно благодаря этим методам можно выявить причину возникновения и проявления инфекционных болезней у живых организмов и дать верную характеристику возбудителям этих болезней.

Краткий курс для иностранцев. Введение понятие о микробах. Методы исследования в микробиологии

Название: Методы микробиологической диагностики
Раздел: Рефераты по биологии
Тип: реферат Добавлен 09:33:06 09 мая 2006 Похожие работы
Просмотров: 8637 Комментариев: 13 Оценило: 6 человек Средний балл: 5 Оценка: 5 Скачать
Название Введение понятие о микробах. Методы исследования в микробиологии
Анкор Краткий курс для иностранцев.doc
Дата 01.12.2020
Размер 0,67 Mb.
Формат файла
Имя файла Краткий курс для иностранцев.doc
Тип Документы
#36875
страница 1 из 14
Каталог

ПОНЯТИЕ О МИКРОБАХ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В

Объектом изучения микробиологии являются микроорганизмы — мельчайшие невидимые не вооруженным глазом одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или растительного царства.

— малые размеры (обычно их измеряют в микрометрах — 10″ 6 м, мкм и нанометрах 10″ 9 — нм);

-слабая морфологическая дифференцировка (относительно простое строение);

-быстрый рост и размножение (в благоприятных условиях одна особь за сутки может дать потомство в сотни миллионов особей);

— высокая активность обменных процессов (быстрый синтез и разложение веществ, получение энергии);

-повсеместное распространение (связано с выраженной способностью к адаптации).

Микробиология является комплексом наук.

В зависимости от объекта исследования различают:

бактериологию, вирусологию, микологию (объект — грибы), протозоологию (объект — простейшие).

По целям изучения микробиология делится на:

общую, медицинскую, санитарную, ветеринарную, промышленную,

космическую и др.

Задачи медицинской микробиологии:

1. Изучение биологии патогенных (болезнетворных) и нормальных для человека микробов.

2. Изучение роли микробов в возникновении, развитии инфекционных (заразных) болезней и формировании иммунного ответа макроорганизма («хозяина»).

3. Разработка методов микробиологической диагностики, специфического лечения и профилактики инфекционных болезней человека.

Микробы, как наиболее древняя форма жизни, в системе организмов представлены довольно широко. Они входят (наряду с другими организмами) в домен эукариотов, полностью составляют домен прокариотов и царство вирусов.

Прокариоты — это, как правило, одноклеточные организмы, бактерии, отличающиеся слабой морфологической дифференцировкой (доядерные); для них характерно:

— отсутствие окруженногр мембраной ядра (носителем наследственности является нуклеоид замкнутая в кольцо нить ДНК, единственная «бактериальная хромосома»);

— отсутствие органелл (митохондрий, хлоропластов, комплекса Гольджи и др.);


— размножение бинарным делением;

— особое строение и состав клеточной стенки, малые размеры рибосом, своеобразные ферменты белкового синтеза.

Прокариоты разделены на 35 групп: спирохеты, несколько групп собственно бактерий (например, «грамположительные кокки», «спорообразующие грамположительные палочки и кокки», «грамотрицательные аэробные палочки и кокки» и др.), а также риккетсии и хламидии, микобактерии, микоплазмы. В основе деления прокариот на группы лежат: форма и строение клетки, отношение к окраске методом Грама, тип метаболизма и другие признаки. Внутри группы выделены более мелкие таксоны: порядок, семейство, род, вид (основной таксон). Название вида микроба состоит из названия рода и вида. Например, один из возбудителей дизентерии носит название- Shigella zonnei.

Эукариоты Микроскопические — это относительно более высоко организованные одноклеточные и многоклеточные организмы, имеющие сходство с клетками животных (простейшие) и растений (грибы).

Для эукариот характерны:

— наличие истинного ядра, в котором находится набор линейных хромосом, распределяющихся в ходе митоза в дочерние клетки;

— различные органеллы (митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулюм и др.);

— рибосомы большего размера, чем у прокариот;

-способность к эндоцитозу (захвату частиц и растворенных веществ).

Вирусы — это мельчайшие неклеточные организмы, которые можно противопоставить всем другим существам. Основные свойства вирусов:

отсутствие клеточного строения;

— отсутствие собственных метаболических систем (у вирусных частиц — вирионов нет обмена с внешней средой);

— облигатный внутриклеточный паразитизм;

— разобщенный способ размножения;

— наследственный материал (геном) представлен одним типом нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

Методы исследования в микробиологии Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический,’ экспериментальный, иммунологический, молекулярно-генетический.

1. Микроскопический — изучение морфологии микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический — (бактериологический, культурный) -посев материала на питательные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одного вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из конкретного источника в определенное время, (например, штамм №8 Shigella flexneri, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения одной клетки (используется при изучении микробных популяций, в генетических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами. В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы антитела (AT), способные вступать с данным антигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан на выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа свидетельствует о предшествующей встрече с ним микробом: возможно, человек переболел соответствующей инфекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Чисто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентификация по антигенной структуре).

5. Молекулярно-генетический метод — использование моноклональных антител, и современных методов диагностики основанных на обнаружении нуклеиновой кислоты возбудителя (ДНК или РНК), рецепторов клеток и т.д.
МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ.

1Световой микроскоп с иммерсионной системой

Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз, поэтому используются микроскопы с иммерсионной системой («иммерсио» — погружение). Иммерсионная система включает: иммерсионный объектив (х 90 ) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива. Поскольку показатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива. При микроскопии необходимо помнить, что объективы «сухой системы» не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность. Микроскопия с иммерсионной сиетемой позволяет изучать убитые микробы в окрашенном к (стоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клетки) и дифференцировать одни микробы от других. Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами. В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно крупных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым нолем зрения (объективы х 40 или х 8 ) Для микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля». Измерение микробов.Изучение морфологических признаков микробов (длина, ширина, форма) нередко проводят для определения их вида. Размеры клеточных микроорганизмов варьируют от долей микрометра (мкм, 10 -6 м) до нескольких десятков микрометров. Мелкие клетки бактерий имеют размеры 1-2, крупные от 8 до 12 мкм и более. Для измерений используют окуляр-микрометр (встроенную в окуляр прозрачную линейку) и объект микрометр.

2Темнопольный микроскоп (ультрамикроскоп)

Особенностью этого микроскопа является наличие конденсора темного поля (параболоид-конденсора), который концентрирует световой пучок и направляет его на исследуемый объект сбоку. Ввиду того, что прямые лучи отсекаются центральной диафрагмой конденсора, а косые лучи, выходящие по периферии диафрагмы, не попадают в объектив, ультрамикроскоп еет темное поле зрения. При освещении косыми лучами живых и неживых частиц, в т.ч. микробов, часть отраженных лучей попадает в объектив; при этом наблюдается яркое свечение частиц на темном фоне. Темнопольную микроскопию используют для изучения подвижности микробов, наблюдения очень тонких объектов (спирохет) в препарате «раздавленная капля».

Эта разновидность светового микроскопа позволяет изучать структуру живых неокрашенных микробов (прозрачных объектов). При прохождении света через неокрашенные микробные клетки, в отличии от окрашенных, амплитуда снеговых волн не меняется, а происходит лишь их изменение по фазе, что не улавливается глазом человека. Сдвиг по фазе происходит при прохождении участков с большей оптической плотностью (рибосомы, нуклеоид). Специальные

приспособления: фазовый конденсор и объективы с фазовыми кольцами позволяют преобразовать невидимые фазовые изменения в видимые амплитудные.

Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра светятся цветами с большей длиной волны (зеленым, оранжевым и др.). В люминесцентном микроскопе изучают как живые, так и убитые микробы (с «сухой» или иммерсионной системами). Люминесцентная микроскопия позволяет получить контрастное цветное изображение, обнаружить малое количество микробов, изучить их структуру и химический состав, использовать метод иммунофлюоресценции.

Этот прибор отличается от световых микроскопов значительно большей разрешающей способностью (около 0,001 мкм) за счет использования вместо света пучка электронов, а вместо стеклянных оптических — электромагнитных линз. В электронном микроскопе изучают вирусы, ультраструктуру убитыхх микроорганизмов. Приготовление препарата для микроскопического

I — приготовление мазка.

Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.

Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.

Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон,

смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.

Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристалл-виолетом (3-5 минут), а сложных • окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.

Дифференцирующий метод Грама.

После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+), другие — в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.

Гр+ бактерии кокки

палочки (спорообразующие): бациллы, клостридии; палочки (неспорообразующие): коринебактерии, микобактерии, актиномицеты

Гр- бактерии кокки

нейссерии, вейллонеллы; палочки (неспорообразующие): энтеробактерии, вибрионы; извитые: спириллы, спирохеты кампилобактерии.

После высушивания мазки готовы для микроскопии.
Основные формы бактерий

Структура бактериальной клетки. Обязательные (постоянные) структурные элементы

Обязательными структурными элементами бактерий являются: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка.

Цитоплазма прокариотов в отличие от эукариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в клетке бактерий функцию ядра, т.е. является носителем генетической информации, однако, в отличие от ядра эукариотическоЙ клетки, он не имеет ядерной мембраны, не делится митозом. Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида является единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму и состоит яз тонкого слоя фосфолипидов и белка. Функции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта веществ, участие в биосинтезе веществ, делении клетки. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии.

Клеточная стенка у Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидогликан, который придает клеточной стенке прочность.

Клеточная стенка определяет форму бактерий, служит для механической защиты, участвует в питании за счет диффузии и осмоса. У Гр- бактерий клеточная стенка представлена тонким слоем пептидогликана, покрытого наружной мембраной, в состав которой входят белки, фосфолипиды и липополисахариды (ЛПС). Наружная мембрана клеточной стенки патогенных микробов во многом определяет специфичность их взаимодействия с организмом хозяина и помогает в распознавании близкородственных микробов. По компонентам и структуре клеточной стенки, биохимическим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Поэтому лекарственные препараты, специфически воздействующие, например, на бактериальные стенки, безвредны для высших организмов. Клеточную стенку бактерий выявляют при электронной микроскопии, специальным окрашиванием или в опыте плазмолиза.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ 203

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспери­ментальный, иммунологический.

1.Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурные элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический — (бактериологический, культурный) — посев материала на питатель­ные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одною вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из кон­кретного источника в определенное время, (например, штамм Shigella flexneri №8, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в гене­тических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы — антитела (AT), способные вступать с данным ан­тигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан па выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей ин­фекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентифи­кация по антигенной структуре).

Open Library — открытая библиотека учебной информации

Открытая библиотека для школьников и студентов. Лекции, конспекты и учебные материалы по всем научным направлениям.

Категории

Культура Методы исследования в микробиологии

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспериментальный, иммунологический.

1. Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический — (бактериологический, культурный) — посœев материала на питательные среды для выделœения чистой культуры и определœения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одного вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделœенная из конкретного источника в определœенное время, (к примеру, штамм Shigella flexneri №8, выделœенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в генетических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы —

антитела (AT), способные вступать с данным антигеном в специфическое

взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан на выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ(диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей инфекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентификация по антигенной структуре).

Читайте также


ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА Лекция №1 Виды неправильного воспитания в семье 1. Гипопротекция . Выражается недостатком опеки и контроля за поведением детей. Лишь иногда гипопротекция простирается до такой. [читать подробенее]

ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА Лекция №1Объектомизучения микробиологии являются микроорганизмы (микробы) — мельчайшие невидимые одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают. [читать подробенее]

ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА Лекция №1 Чувствуешь себя вялой? Ответь на вопросы и выясни, куда «утекает» твоя энергия. Как часто ты прикладываешь усилия, чтобы другой человек совершил ожидаемые тобой действия. [читать подробенее]

ПРЕДМЕТ И ЗАДАЧИ МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И ЕЕ ЗНАЧЕНИЕ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВРАЧА Лекция №1 Лекція 16. Біотехнології – виробництво майбутнього Лекція 15. Мікроорганізми у виробництві хлібобулочних виробів 1. 1. Объектомизучения микробиологии являются. [читать подробенее]

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспери­ментальный, иммунологический. 1.Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить. [читать подробенее]

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспериментальный, иммунологический. 1. Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить. [читать подробенее]

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ

Шаровидные Палочковидные Извитые
микрококки (одиночные) собственно бактерии спириллы
диплококки (пары) спорообраэующие спирохеты
стрептококки (цепочки) (бациллы, клостридии) кампилобактеры
тетракокки (4 клетки) изогнутые палочки
сарцины (тюки, пакеты) (вибрионы)
стафилококки (гроздья)
Прочитайте:

  1. I. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  2. II МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  3. II. Методы, подход и процедуры диагностики и лечения
  4. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  5. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  6. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  7. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  8. Iv. Методы коррекции эмоционального стресса
  9. VI. ЛАБОРАТОРНЫЕ И ИНСРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
  10. X. Освенцим: научные исследования

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспери­ментальный, иммунологический.

1.Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2.Микробиологический — (бактериологический, культурный) — посев материала на питатель­ные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одною вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из кон­кретного источника в определенное время, (например, штамм Shigella flexneri №8, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в гене­тических экспериментах).

3.Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы — антитела (AT), способные вступать с данным ан­тигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан па выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей ин­фекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентифи­кация по антигенной структуре).

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 337 | Нарушение авторских прав

Аллергологический метод исследования в микробиологии. Иммунно-аллергологическое обследование. Как выявить аллерген: лабораторный тест на аллергическую реакцию

Существует множество способов диагностики аллергии. Правильный диагноз можно поставить только после комплексного обследования и никогда — после одного анализа. Комплексное аллергологическое обследование начинается с беседы с врачом-аллергологом. Врач расспрашивает о жалобах, о начале заболевания, особенностях его развития, об условиях, в которых аллергическая реакция выражена максимально, о наличии подобных заболеваниях у родственников, условиях быта и работы и т.п. После этого врач назначает определенные методы диагностики.

Кожные пробы

Обследование методом укола (прик-тестирование) или царапины (скарификационный тест) проводится для того, чтобы определить, какие аллергены могут иметь значение в развитии симптомов у конкретного человека. Это абсолютно безболезненные методы. Разница между ними несущественна, первый метод считается более безопасным.

Исследование, как правило, проводят на коже предплечья, которую предварительно обрабатывают спиртовым раствором. Далее, на чистую кожу наносят капли аллергенов. В случае скарификационных тестов, через капли аллергенов, одноразовым скарификатором, наносятся небольшие царапины. В случае прик-тестов используют одноразовые иглы, ими наносят легкие уколы (на один миллиметр в глубину). И в том, и в другом случае кровеносные сосуды не задеваются, то есть оба метода бескровные. Не ставят более 15 проб с аллергенами за один раз. Через некоторое время возможно развитие небольшого отека и покраснения кожи, что предполагает аллергию на соответствующее вещество.

Исследование специфических антител Ig E

Такой анализ на антитела, ответственных за развитие аллергии, помогает установить группу причинных аллергенов. Метод очень чувствительный, а полученная информация является по своей сути схожей с той, что получена в результате кожного тестирования. Для проведения этого анализа нужно будет сдать кровь из вены.

Провокационные тесты

Кожное тестирование и исследование крови на IgE указывают на те аллергены, которые потенциально могут вызвать аллергические реакции у данного человека. Если после кожных проб и исследования крови, диагноз остается неясным, врач может назначить провокационные тесты. Такие исследования проводятся в аллергологических стационарах по строгим показаниям. При проведении провокационных тестов в нос, под язык или непосредственно в бронхи вводится небольшое количество аллергена, а через некоторое время оценивается реакция. Такое исследование может вызывать у больного сильную аллергическую реакцию, поэтому должно проводиться в присутствии врача, который может оказать немедленную медицинскую помощь.

Элиминационные тесты

Если контакт с аллергеном постоянный, то для подтверждения того, что данный конкретный аллерген вызывает клинические проявления аллергии, используют элиминационные тесты. Элиминация — это удаление аллергена. Типичный пример элиминационного теста — элиминационная диета. Это диагностический прием, который заключается в полном выведении из рациона предполагаемого аллергенного продукта. Если после исключения продукта в течение 7 — 14 дней наступает видимое улучшение течения болезни, то можно говорить о том, что этот продукт является причиной аллергии.

Для диагностики аллергии и коррекции лечения врач может попросить вести специальный дневник, в котором больной будет отмечать время начала аллергии, проявления и возможную причину. Это позволить назначить профилактическое лечение или исключить контакт с аллергеном, например, в случае с аллергией на пыльцу или пищевой аллергией.

Лабораторные методы диагностики аллергии — это всего лишь часть комплексного аллергологического обследования. На их основании врач может предположить причину аллергии. Точный диагноз можно поставить только при совокупности всех данных: опроса, осмотра, лабораторных данных и реакции на лечение.

Специфические методы аллергологической диагностики

Кожные пробы нашли самое широкое применение как метод определения аллергена. Метод малотравматичен, относительно безопасен и довольно специфичен (т. е. с высокой долей достоверности можно определить причинный аллерген). Сочетание тщательно собранного анамнеза с хорошо продуманной обширной программой кожных проб является основой диагностического подхода к аллергологическим проблемам. В основном кожные пробы применяются для выявления специфических аллергенов при заболеваниях, вызванных реакциями гиперчувствительности немедленного типа (I тип). К таковым можно отнести аллергический ринит, астму, атопическую экзему, анафилаксию, крапивницу. На кожу больного воздействуют небольшим количеством аллергена, чем вызывают развитие аллергической реакции в миниатюре. Кожные пробы ставят, как правило, в период ремиссии. Методики выполнения кожных проб могут быть различны: насечки, уколы, внутрикожное введение аллергена, лекарственный электрофорез. Таким образом, по выбранному методу проба может быть кожной и внутрикожной. Основными целями кожных проб являются:

– выявление основных аллергенов, не установленных по данным анамнеза аллергического заболевания;

– подтверждение наличия аллергенов, предполагаемых на основании данных аллергологического анамнеза.

Метод кожных проб основан на наличии антител не только в шоковом органе, но и в коже (реагины). Поэтому при встрече с «родственным» аллергеном происходит аллергическая реакция с высвобождением гистамина и образованием волдыря или воспалительной аллергической гиперемии. В настоящее время известно большое количество диагностических аллергенов как инфекционного, так и неинфекционного ряда. Кожные пробы противопоказаны в период обострения аллергического заболевания, основного (неаллергического) заболевания, во время лечения гормонами и антигистаминными препаратами (так как эти медикаменты могут искажать (снижать) кожную чувствительность). Интенсивность кожных проб оценивают либо плюсами (от 0 до 4), либо по диаметру «пуговки», или очага гиперемии (покраснения кожи).

Учитывая возможность развития серьезных осложнений, вплоть до анафилактического шока, при несоблюдении техники постановки кожных проб, а также сложность интерпретации полученных результатов, проведение кожных проб возможно только в аллергологических кабинетах специально обученным персоналом под наблюдением врача-аллерголога.

Помимо кожных проб, для диагностики в аллергологии широко используются провокационные пробы в виде специальных тестов. При помощи провокационных проб (тестов) выявляют (уточняют) причиннозначимый аллерген. В основе тестов лежит введение аллергена в шоковый орган. Если аллерген причиннозначим, значит, происходит реакция аллергического воспаления. Шоковым органом называется тот орган, поражение которого является ведущим в картине заболевания. По виду шокового органа выделяют следующие виды провокационных проб:

I. Конъюнктивальный провокационный тест, применяемый для выявления аллергенов, вызывающих развитие аллергического конъюнктивита или поллиноза, протекающего с явлениями конъюнктивита. Необходимо соблюдать осторожность при его проведении из-за опасений вызвать резкую воспалительную реакцию. Противопоказания те же, что и для кожных проб. В конъюнктивальный мешок, отодвинув нижнее веко, закапывают несколько капель тест-контрольной жидкости. Затем веки можно сомкнуть. При отсутствии воспалительной реакции закапывают капли аллергена (в разведении). При появлении зуда, воспаления век, слезотечения тест считается положительным.

II. Назальный провокационный тест считается наиболее безопасным. Проводится преимущественно при поллинозах с клиническими проявлениями ринита и аллергических ринитах. Эта проба проста и легковыполнима в условиях аллергологического кабинета. Противопоказания – как и у кожных проб. Аллерген (после предварительного введения тест-контрольной жидкости) в соответствующем разведении закапывают в одну половину носа. При положительной реакции появляются чиханье, зуд в носу, затрудненное дыхание через данную половину носа. При специальном осмотре слизистой данной половины носа (при риноскопии) можно определить набухание слизистой оболочки носа, сужение носового прохода.

III. Ингаляционный провокационный тест обычно применяется для специфической диагностики различных форм бронхиальной астмы. Тест выполняется строго в условиях стационара, так как возможно развитие тяжелого приступа бронхиальной астмы сразу или через несколько часов, поэтому за тестируемым необходимо наблюдение. Этот тест наиболее специфичен (т. е. с большой достоверностью позволяет выявить причиннозначимый аллерген), так как аллерген вводят естественным путем. Для того чтобы аллерген попал на слизистую оболочку дыхательных путей, он должен быть распылен, после чего больной вдыхает его. В ответ на попадание аллергена в шоковый орган (легкие) возникает бронхоспазм, который свидетельствует о причинной значимости аллергена. Детям этот тест проводят лишь с 4-5 лет с большой осторожностью и предварительной подготовкой. Для снятия возникшего во время исследования бронхоспазма необходима ингаляция одного из бронхоспазмолитических препаратов («беротек», «вентолин» и др.).

Существуют и другие виды провокационных тестов, такие как холодовой, тепловой, лейкоцитопенический, тромбоцитопенический, экспозиционные.

С помощью провокационных тестов хорошо выявляются атопический и иммунологический типы аллергических реакций. Труднее диагностируется аллергическая реакция замедленного типа.

Это способ выявления возбудителя аллергии (причиннозначимого аллергена) основан на исчезновении или ослаблении аллергической реакции после прекращения контакта больного с аллергеном. Элиминационные тесты были предложены для диагностики пищевой аллергии и нашли широкое применение в детской практике. Как показывает само название, проба связана с исключением из диеты больного подозреваемого аллергена. Необходимо исключить из рациона не только подозреваемый аллерген в чистом виде, например яйцо, но и блюда, содержащие его (булки, печенье, кремы, омлеты и т. д.). Второе необходимое условие чистоты эксперимента – это длительность элиминации (не менее 7-12 дней). Обычно элиминационный тест используется в диагностике пищевой и (реже) лекарственной аллергии. После наступления ремиссии (исчезновение проявления болезни) этот тест сочетают с применением провокационного теста с данным аллергеном.

Лабораторные методы диагностики

Лабораторные методы диагностики аллергических заболеваний в отличие от вышеперечисленных клинических методов диагностики имеют ряд преимуществ, так как не связаны с введением подозреваемого аллергена в высокочувствительный организм. А значит, они полностью безопасны для пациентов. Приоритетное значение лабораторные методы диагностики имеют тогда, когда не удается добиться периода ремиссии, а выявить аллерген крайне необходимо.

При использовании методов лабораторной диагностики (другими словами, иммунологических методов исследования) необходимо учитывать некоторые положения. Во-первых, все иммунологические методы диагностики выявляют лишь состояние сенсибилизации, т. е. свидетельствуют о том, что у данного человека когда-то уже был контакт с данным аллергеном. Из этого вовсе не следует, что именно на данный аллерген разовьется аллергическая реакция, потому что для реализации аллергии необходим еще ряд дополнительных условий. Во-вторых, у разных типов иммунологических реакций имеются различные иммунологические механизмы, поэтому для диагностики необходимо применять несколько методов. К наиболее простым методам относятся методы, основанные на реакциях клеток крови, так как клетки крови могут быть носителями антител (лимфоциты) и фиксировать на себе комплекс «антиген – антитело» (тромбоциты, эритроциты, зернистые лейкоциты, базофилы). На этих свойствах клеток крови основаны некоторые методы лабораторной диагностики, например тест на выброс веществ воспаления из базофильных лейкоцитов, тучных клеток соединительной ткани и др. Диагностическая значимость указанных методов далеко не равнозначна. Их применение определяется задачами исследования, характером процесса и другими факторами. Итак, подытоживая все вышесказанное, ответим на вопрос: как же распознать аллергию? Как уже отмечалось, часто распознавание аллергических реакций и заболеваний не представляет большой трудности. Когда больной обращается за медицинской помощью, ему необходимо рассказать доктору:

– о характере течения заболевания и его тяжести;

– о своих жалобах, т. е. о субъективных ощущениях;

– о том, как протекают приступы аллергии – сезонно или непрерывно;

– о том, на какие виды пищевых продуктов и лекарств бывают аллергические реакции;

– о том, есть ли дома домашние животные, птицы, аквариум, имеется ли и с какой частотой контакт с пылью, косметическими средствами, инсектицидами и т. д.;

– о состоянии пищеварительного тракта (есть ли запоры, поносы);

– о том, бывают ли и как часто головные боли, охарактеризовать их длительность и локализацию;

– об очагах хронической инфекции (хронический гайморит, отит, кариозные зубы, наличие глистной инвазии, лямблиоза и т. д.);

– обо всех перенесенных болезнях и лекарствах, которыми их лечили, о реакциях на инъекции иммуноглобулинов; о наличии или отсутствии в анамнезе жизни (т. е. в истории жизни) внутривенных переливаний крови и ее препаратов.

Заключение о типе процесса и его причине дается на основе обобщенных результатов анамнеза, клинического обследования и указанных методов исследования.

Из книги Секреты целителей Востока автора Виктор Федорович Востоков

Методы диагностики На протяжении многовекового развития народной медицины восточные целители разработали своеобразные методы обследования больных и диагностирования болезней. Многие из этих методов используются и в современной медицине.Вначале их было четыре:

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ Как и в любой другой болезни, лечение бесплодия во многом зависит от своевременной и правильной постановки диагноза. К счастью, на сегодняшний день диагностика бесплодия в семье представляет собой тщательно изученный и отработанный

Современные методы диагностики Известно, что рак не возникает внезапно, а спустя 5, 10, а то 20 лет после предшествующих хронических заболеваний. По данным Санкт-Петербургского ГУН НИИ онкологии имени профессора Н. Н. Петрова, рак молочной железы развивался на почве

Методы диагностики Для точной постановки диагноза эффективен комплексный подход. Он позволяет установить тяжесть заболевания, локализацию поражения кишечника, степень и характер изменений. Для этого используют ректороманоскопию, колоноскопию, ректороманобиопсию,

МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ОСТЕОПОРОЗА К таким методикам прежде всего относят инструментальные и лабораторные методы исследований.Рентгенологическое исследование костей. Данная методика информативна лишь при изменениях, когда костная масса уже потеряна на 1/5-1/3 своей

3. Основные методы лечения столбняка. Специфические и неспецифические методы лечения К неспецифическим методам лечения относится ряд мероприятий. В первую очередь это госпитализация больного в специализированный стационар с обязательным помещением в отдельную палату

Методы диагностики Вероятнее всего, что к врачу вас приведет боль. Боль, которая вымотала вас и с которой непонятно, что делать. Остальное мы будем по привычке терпеть и до последнего откладывать визит к доктору, что, конечно, не может вызвать одобрения и достойно

Дополнительные методы диагностики При ощупывании тела пациента врач тибетской медицины выявляет болезненность точек акупунктуры, соответствующих и связанных энергетически с теми или иными внутренними органами. Эти точки располагаются на меридианах, которые являются

Инструментальные методы диагностики Выбор диагностических методов, а также последовательность процедур определяет только лечащий врач. Я познакомлю вас с наиболее распространенными методами диагностики ишемической болезни сердца, расскажу, как их выполняют и как к

Лабораторные методы диагностики Организм человека – одна из самых сложных и совершенных систем живой природы, нормальная жизнедеятельность которого требует достаточно жесткого постоянства его внутренней среды. Процессы, происходящие в клетках и тканях организма,

НОВЕЙШИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ Радионуклидные методы весьма перспективны (имеется в виду создание опухолеспецифических меченых антител). В настоящее время для диагностики метастазов применяют сцинтиграфию костей скелета, мозга, легких, для характеристики

Клинические методы диагностики К клинической диагностике можно отнести сбор анамнеза, т. е. истории заболевания аллергией. Сбор аллергологического анамнеза является первой возможностью для врача и больного установить между собой хорошее взаимопонимание. Эффективные

Современные методы диагностики гипертонии Диагностика гипертонии проводится в лечебном учреждении. Опросив и осмотрев больного, врач измеряет его АД (как правило, измерения проводятся в течение нескольких дней и даже недель подряд), назначает лабораторные анализы и,

Методы диагностики гипотонии Современная медицина имеет в своем арсенале несколько методов диагностики артериальной гипотензии, позволяющих с уверенностью сделать вывод о наличии и степени тяжести заболевания. Наиболее точный результат достигается при сочетании

Вопрос 24. Методы диагностики туберкулеза 1. Выявление новых случаев туберкулеза возможно различными способами, в последние годы доля каждого из них заметно меняется. Неоднозначна и точка зрения на то, как лучше выявлять туберкулез. Остановимся на большинстве известных

Вопрос 25. Методы диагностики туберкулеза Частота выявления «виражных» детей и подростков, так же как и инфицированность населения (процент положительно реагирующих на туберкулин людей среди всех, кому проведена туберкулиновая проба), отражают эпидемиологическую

15.1. Характеристика микробиологических и иммунологических лабораторий

Вся работа с микробами проводится в лабораториях, которые в зависимости от основных задач могут быть научно-исследовательскими, диагностическими или производственными.

В системе органов здравоохранения имеются:

Клинико-диагностические лаборатории общего или специального (биохимическая, бактериологическая, иммунологическая, цитологическая и др.) типов, входящие в состав больниц, поликлиник, диспансеров и других лечебно-профилактических учреждений;

Бактериологические лаборатории Госсанэпиднадзора (ГСН);

Санитарно-бактериологические лаборатории ГСН;


Санитарно-химические лаборатории ГСН;

Центральные (ЦНИЛ), проблемные, отраслевые, учебные лаборатории вузов;

Специализированные лаборатории (особо опасных инфекций и др.).

В настоящее время лаборатории и более крупные лабораторные учреждения (отделы, институты, производственные предприятия), как правило, специализированные и работают с той или иной группой микробов.

С вирусами работают в вирусологических лабораториях, располагающих соответствующим оборудованием и использующих спе- циальные методы исследования. Существуют микологические и протозоологические лаборатории. Специализированный характер

приобретают и бактериологические лаборатории, в которых работа концентрируется на определенных группах бактерий, например риккетсиозные, туберкулезные, лептоспирозные, анаэробные и др. Иммунологические исследования проводятся в иммунологических лабораториях, хотя отдельные виды исследований могут выполняться и в микробиологических лабораториях, например серодиагностика инфекционных болезней.

Лабораторная работа с патогенными микробами проводится в специально оборудованных лабораториях, обеспечивающих режим работы и технику безопасности, исключающих возможность заражения персонала и утечку микробов за пределы лаборатории.

Необходимость четкой регламентации условий работы с микробами, в различной степени опасными для сотрудников ла- бораторий и окружающего населения, обусловила разработку классификации микробов, разбив их на 4 группы по степени их биологической опасности (классификация ВОЗ). В России в соответствии с рекомендациями ВОЗ патогенные микробы также делят на 4 группы: 1-я группа — возбудители особо опасных инфекций; 2-я группа — возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний человека; 3-я группа — возбудители инфекционных болезней, выделяемые в самостоятельные нозологические группы; 4-я группа — условно-патогенные микробы — возбудители оппортунистических инфекций. Нумерация групп микробов, принятая в России, отличается обратным порядком от классификации ВОЗ, где к 1-й группе относятся микробы самой низкой патогенности, а к 4-й группе — особо опасные.

В соответствии с делением микробов на группы по степени биологической опасности лаборатории также делят на категории. По номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:

Базовые (основные или общего типа) лаборатории, которые в связи с конкретными особенностями работы могут быть оборудованы различными защитными устройствами;

Режимные (изолированные) лаборатории и лаборатории особого режима (максимально изолированные).

Безопасность работ в лабораториях всех категорий обеспечивается выполнением распорядка и правил работы в лаборатории, выполнением требований к лабораторным помещениям и их оснащению, обеспечением лабораторий соответствующим оборудова-

нием, медицинским наблюдением за состоянием здоровья сотрудников, обучением и тренировкой персонала технике безопасности в лаборатории.

15.2. Оснащение микробиологических и иммунологических лабораторий

Помещения базовой лаборатории должны быть просторными для обеспечения безопасного проведения лабораторной работы. Стены, потолок, пол должны иметь гладкую, легко моющуюся поверхность, непроницаемую для жидкостей, устойчивую к дезинфектантам, обычно используемым в лаборатории. Поверхность рабочих столов должна быть водонепроницаемой, устойчивой к дезинфектантам, кислотам, щелочам, органическим растворителям и умеренному нагреванию. Лабораторная мебель должна быть прочной. Пространство под столами и между мебелью должно быть легкодоступно для уборки. В лаборатории должен находиться автоклав для обеззараживания отходов.

Оборудование базовой лаборатории должно ограничивать или предупреждать контакт микробиолога с инфекционным матери- алом, должно быть изготовлено из прочных материалов, непроницаемых для жидкостей, устойчивых к коррозии. Оборудование должно быть сконструировано и установлено так, чтобы оно легко подвергалось чистке, обеззараживанию и проверке.

Лабораторию оснащают микроскопом, автоклавом, термостатами, сушильными, стерилизационными шкафами, аппаратом для свертывания сыворотки, дистиллятором, центрифугами, лабораторными весами, рН-метром, ФЭК, магнитной мешалкой, моечной ванной.

Рабочие помещения лаборатории должны быть снабжены подводкой холодной и горячей воды, электричеством, вакуумом, кис- лородом, воздухом высокого давления и т.п. В некоторых кабинетах оборудуются боксы и вытяжные шкафы.

В число обязательных помещений входят лаборатории кишечных, капельных инфекций, санитарно-бактериологическая, се- рологическая, а также вспомогательные помещения: средоварка, моечная, стерилизационная (чистая и грязная), регистратура, кладовые, санузел для сотрудников, виварий. В лабораториях с пунктами для обследования на носительство микроорганизмов дополнительно оборудуют приемную, процедурную, туалеты для забора

материала. Располагают помещения таким образом, чтобы грязный и чистый потоки не перекрещивались и не соприкасались.

В отношении помещений режимных лабораторий должны соблюдаться те же требования, которые предусмотрены для базовой лаборатории. Кроме того, лаборатория этого типа должна быть отделена от тех частей здания, где передвижение сотрудников не ограничивается. Устройства для мытья рук должны быть снабжены приспособлениями для открывания воды ножной педалью или локтем. Окна должны быть закрыты и заклеены. Входные двери в лабораторные помещения должны быть самозакрывающимися и запирающимися на замок. Вытяжная вентиляция проектируется так, чтобы наиболее низкое давление создавалось в помещениях самой высокой опасности инфицирования. В этом случае движение воздуха будет происходить из вспомогательных помещений в направлении основного рабочего помещения. Отработанный воздух выбрасывается в окружающую среду только после фильтрации через бактериальные фильтры. При оснащении режимных лабораторий оборудованием руководствуются рекомендациями, разработанными для базовых лабораторий, с тем дополнением, что вся работа с инфекционным материалом в них проводится в защитных боксах. В режиме максимально изолированных лабораторий существует ряд особенностей для обеспечения максимальной биологической безопасности персонала, населения и окружающей среды. Вход в лабораторию и выход из нее осуществляются через санитарный пропускник. При входе обязательно полное переодевание в специальную одежду, при выходе перед переодеванием обязательна целевая санитарная обработка (душ, дезинфектанты) персонала. Для снижения риска попадания инфекционного мате- риала в окружающую среду применяют боксирование. С помощью боксов (настольных, ламинарных) создают физические барьеры для предотвращения возможных контактов работающего персонала с инфекционным материалом.

15.3. Правила работы в микробиологической лаборатории

Основные правила работы в базовой лаборатории включают:

Запрет работ с пипеткой при помощи рта;

Запрет приема пищи, питья, курения, хранения пищи и применения косметических средств в рабочих помещениях;

Поддержание чистоты и порядка;

Дезинфекцию рабочих поверхностей не реже 1 раза в день и после каждого попадания на них заразного материала;

Мытье рук персоналом после работы с заразным материалом, животными, перед уходом из лаборатории;

Проведение всех работ таким образом, чтобы свести к минимуму возможность образования аэрозоля;

Обеззараживание всех инфицированных материалов перед выбросом или повторным использованием.

15.4. Принципы микробиологической диагностики инфекционных болезней

Наиболее важное место в лабораторной диагностике инфекционных болезней занимает специфическая микробиологическая диагностика, которую проводят в бактериологической, вирусологической, иммунологической и других лабораториях. Она состоит из трех этапов: преаналитического, аналитического и постаналитического.

Первым этапом микробиологической диагностики является преаналитический, включющий взятие материала для исследования. Выбор исследуемого материала определяется патогенезом и клинической картиной инфекционного заболевания. Исследуемый материал берут по возможности в асептических условиях, помещают в стерильную посуду и как можно быстрее доставляют в лабораторию (желательно в течение 1 ч). В некоторых случаях посев материала проводят у постели больного. Иногда допускается непродолжительное хранение материала в регламентированных условиях. Исследуемый материал сопровождается документом, в котором обязательно указываются время взятия, характер материала, его источник и точно определяется цель исследования.

Материалом для исследования в медицинской микробиологии служат различные биологические и патологические жидкости организма (кровь, гной, моча, мокрота, ликвор, испражнения, рвотные массы, промывные воды и т.п.) и ткань — материал биопсии от живого или аутопсии от трупа. В санитарной микробиологии на исследование берут объекты окружающей среды (воздух, воду, пищевые продукты и т.п.) или смывы с них. При заборе материа-

ла для микробиологического исследования необходимо соблюдать следующие правила:

Материал берут непосредственно из очага инфекции или исследуют соответствующее отделяемое (гной, мочу, желчь и т.п.);

Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования и его повторения в случае необходимости;

Материал берут по возможности в начальном периоде болезни, так как именно в этот период возбудители выделяются чаще, их больше, они имеют более типичную локализацию;

Материал берут до начала антимикробной химиотерапии или через определенный промежуток времени после приема антибактериального препарата, необходимый для его выведения из организма;

Следует предупредить возможность попадания в материал антимикробных препаратов (дезинфектанты, антисептики, антибиотики);

Транспортировку материала в лабораторию следует проводить в максимально короткие сроки, в условиях, исключающих гибель неустойчивых видов микробов, или помещать его в специальные транспортные среды;

При транспортировке должны соблюдаться все правила биологической безопасности;

К материалу прилагают сопроводительный документ, содержащий основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования (фамилия, имя, отчество больного, номер истории болезни, клинический диагноз и т.д.).

15.5. Методы микробиологической диагностики

Аналитический этап включает микроскопический, культуральный, биологический, серологический и аллергологический методы микробиологической диагностики.

Микроскопический метод заключается в приготовлении препаратов (нативных или окрашенных простыми или сложными методами) из исследуемого материала и их микроскопии с применением различных видов микроскопической техники (световая, темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная, электронная и др.). В бактериологии микроскопический метод получил название бактериоскопического, в вирусологии — вирусоскопического.

Культуральный метод заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В бактериологии культуральный метод получил название бактериологического, в микологии — микологического, в протозоологии — протозоологического, в вирусологии — вирусологического.

Биологический метод (экспериментальный или биопроба) заключается в заражении исследуемым материалом чувствительных лабораторных животных или других биологических объектов (куриные эмбрионы, культуры клеток). Его используют для выделения чистой культуры возбудителя, определения типа токсина, активности антимикробных химиотерапевтических препаратов и т.д.

Серологический метод заключается в определении титра специфических антител в сыворотке крови больного, реже — в обнаружении микробного антигена в исследуемом материале. С этой целью используются иммунные реакции.

Аллергологический метод заключается в выявлении инфекционной аллергии (ГЗТ) на диагностический микробный препараталлерген. С этой целью ставят кожные аллергические пробы с соответствующими аллергенами.

Диагностическая ценность этих методов неравнозначна. Ведущим методом микробиологической диагностики является бак- териологический метод, так как он позволяет выделять и иден- тифицировать микроб-возбудитель, т.е. первопричину болезни. Остальные методы менее информативны, так как они позволяют обнаружить в организме изменения, обусловленные наличием в нем микроба. Второе место по значимости занимает серологический метод, поскольку взаимодействие антигена и антитела характеризуется высокой степенью специфичности. Информативность трех остальных методов невысокая, и они обычно служат дополнением к бактериологическому и серологическому методам. Так, микроскопия исследуемого материала далеко не всегда позволяет увидеть и идентифицировать микробы под микроскопом. Их удается обнаружить только при высокой обсемененности ими материала. Даже обнаружив бактерии под микроскопом, идентифицировать их до вида морфологически нельзя. Как известно, все видовое многообразие бактерий сводится к 4 основным морфологическим формам: кокки, палочки, извитые и ветвящиеся формы. Поэтому по микро-

скопической картине можно весьма ориентировочно отнести увиденные бактерии к крупному таксону, например грамположительным коккам. Только в единичных случаях, когда бактерии имеют уникальную морфологию, микроскопически можно определить их родовую принадлежность. Информативность микроскопического метода грибов и простейших выше, так как грибы и простейшие, являясь эукариотами, имеют более крупные размеры и более характерную морфологию.

Диагностические возможности биологического метода ограничены тем, что к большинству возбудителей антропонозных инфек- ций человека лабораторные животные невосприимчивы, поэтому вызвать у них экспериментальную инфекцию не представляется возможным.

Возможности аллергологического метода ограничены тем, что большинство микробов в организме человека не вызывают ГЗТ.

Поскольку микробиологические исследования являются одним из наиболее дорогих видов лабораторных исследований, перед ми- кробиологом стоит задача постановки достоверного микробиологического диагноза с наименьшей затратой времени, сил и средств. Поэтому для постановки диагноза используют 1-5 методов диагностики, чтобы выбранный набор методов гарантировал правильность ответа.

Особое значение приобретают методы экспресс-диагностики, которые позволяют поставить микробиологический диагноз в течение короткого промежутка времени (от нескольких минут до нескольких часов) с момента доставки исследуемого материала в лабораторию. К числу экспресс-методов относятся РИФ, ИФА, РИА, ПЦР, использование биочипов, хроматография и др. Особенности диагностики анаэробных инфекций изложены в материалах диска.

Наряду с традиционными классическими методами микробиологической диагностики в последние годы все большее значение приобретают молекулярно-биологические методы диагностики (ДНК-зонды, ПЦР, лигазная цепная реакция — ЛЦР, хроматография, электрофорез, иммуноблот, биочипы и др.).

Молекулярно-биологические методы диагностики основаны на идентификации ДНК и РНК, специфичных для данного вида микробов, и включают гибридизацию на основе ДНК-зондов и диагностику на основе ПЦР.

Постаналитический этап микробиологической диагностики заключается в клинической интерпретации результатов лабораторных исследований. При этом лечащий врач должен оценить этиологическое значение выделенных от больного микробов, скорректировать на основании данных микробиологического мониторинга проводимую больному эмпирическую антимикробную химиотерапию и др.

15.5.1. Методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций

В бактериологии для обнаружения возбудителя в исследуемом материале используют бактериоскопический, бактериологический, биологический методы.

Достоинствами бактериоскопического метода являются простота, быстрота, экономичность. Однако он находит ограниченное применение, так как может быть использован лишь при наличии каких-либо морфологических или тинкториальных особенностей возбудителя и достаточном его содержании в исследуемом материале. Данный метод является ориентировочным.

Основной и самый точный метод диагностики бактериальных инфекций бактериологический, который используют почти при всех заболеваниях, несмотря на его недостатки: длительность исследования (от 4-5 дней до 2 мес), опасность (так как накапливается чистая культура возбудителя), сравнительную дороговизну. В том случае, если в исследуемом материале предполагается содержание возбудителя в достаточном количестве, посев материала производят на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. При незначительном содержании микробов исследуемый материал прежде засевают на жидкие питательные среды — среды обогащения. Идентификацию выделенной чистой культуры производят по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным и токсигенным свойствам (в зависимости от вида возбудителя). Определение перечисленных свойств позволяет установить вид возбудителя. С целью эпидемиологического маркирования производят внутривидовую идентификацию выделенной культуры: определяют ее фаговар, биовар и др. Кроме того, для назначения рационального лечения, как правило, опре- деляют чувствительность выделенной культуры к антибиотикам.

При микробиологической диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микробами, представителями нормальной микрофлоры, обязательным является определение количества воз- будителей в исследуемом материале.

Биологический метод неэкономичен, негуманен, поэтому находит ограниченное применение. В качестве экспериментальных животных используют белых мышей, морских свинок, кроликов, обезьян и других животных.

Диагноз инфекционного заболевания возможно установить также с помощью серологического метода, позволяющего обнаружить либо специфические антитела в сыворотке больного, либо специфические антигены непосредственно в исследуемом материале. Антитела к возбудителю заболевания появляются, как правило, к концу первой недели болезни. Невозможность обнаружить их в первые дни заболевания является серьезным недостатком метода, особенно в тех случаях, когда заболевание протекает остро. Кроме того, при многих болезнях требуются изучение антителообразования в динамике и выявление увеличения количества антител, что также не позволяет быстро поставить диагноз. Недостатком метода является и то, что с его помощью нельзя точно идентифицировать возбудителя и определить его антибиотикограмму. Но в то же время это совершенно безопасный, относительно недорогой метод, позволяющий за короткое время поставить диагноз. В настоящее время при ряде болезней определяют не только количество, но и классы иммуноглобулинов.

При некоторых заболеваниях серологический метод применяют для выявления специфических антигенов в исследуемом ма- териале. Поскольку специфические антигены, входящие в состав возбудителя, находятся в патологическом материале с первых минут болезни, этот вариант серологического метода применяют для ускоренной (в течение первого дня болезни) или даже экспрессдиагностики (в течение нескольких часов) инфекционных заболеваний.

В качестве вспомогательного при небольшой группе инфекционных заболеваний используют аллергологический метод, по- зволяющий выявить повышенную чувствительность к специфическому антигену (аллергену), которым является возбудитель заболевания.

15.5.2. Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций

В вирусологии методы лабораторной диагностики вирусных инфекций имеют свою специфику, учитывая особенности биологии вирусов. Используются вирусоскопический, вирусологический и серологический методы лабораторной диагностики.

Вирусоскопический метод заключается в обнаружении вируса в исследуемом материале под микроскопом. Чаще используют электронный микроскоп, реже — люминесцентный. Световая микроскопия из-за ничтожно малых размеров вирусов практически не применяется. Лишь для обнаружения крупных вирусов, используя методы сверхокраски, можно применить световой микроскоп. Кроме того, с помощью светового микроскопа можно выявить внутриклеточные включения, которые образуются в пораженных клетках при некоторых инфекциях.

Вирусологический метод заключается в заражении исследуемым материалом чувствительной биологической модели (лабораторные животные, куриные эмбрионы или культуры клеток), индикации вируса и его последующей идентификации. При заражении лабораторных животных индикация вирусов производится, как правило, по клинической картине болезни, патолого-анатомическим изменениям ориентировочно и окончательно, например, с помощью реакции гемагглютинации. Эта же реакция позволяет выявить вирусы в курином эмбрионе, видимых изменений при вскрытии которого, как правило, не наблюдается. В культуре клеток наличие вируса определяют по цитопатическому действию (в том числе образованию внутриклеточных включений), гемадсорбции, феномену бляшкообразования, реакции гемагглютинации, отсутствию изменения окраски индикатора. Идентификация вируса осуществляется с помощью серологических реакций (РПГА, РТГА, РН, РСК, ИФА и др.). Вирусологический метод позволяет точно определить природу возбудителя, но он требует достаточного времени (5-7 дней и более), значительных материальных затрат и небезопасен.

Особенностью серологического метода в вирусологии является исследование парных сывороток. Первую сыворотку берут у больного в острый период в начале болезни, хранят при температуре 4-8 ?С, а вторую сыворотку берут через 10-14 дней. Сыворотки

исследуют одномоментно. О болезни свидетельствует сероконверсия, т.е. нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой. Диагностической является сероконверсия в 4 раза и выше. Так как многие вирусные болезни протекают остро, этот вариант серологического метода обычно применяют для ретроспективной диагностики.

Ведущим методом лабораторной диагностики вирусных инфекций является вирусологический.

Ускоренная и экспресс-диагностика вирусных болезней производится так же, как при бактериальных инфекциях.

15.5.3. Особенности микробиологической диагностики микозов

Для диагностики грибковых инфекций обычно используют микроскопический метод. Микологический метод заключается в по- севе патологического материала на специальные питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и ее идентификации по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Особенностью данного метода является его продолжительность — несколько недель из-за медленного роста грибов. Обнаружение антител при серологическом исследовании возможно со 2-4-й нед болезни. При некоторых заболеваниях выявляют специфические антигены в исследуемом материале. Аллергологический метод используют редко. Нередко при микозах применяют гистологический метод, заключающийся в обнаружении элементов гриба (споры, конидиальные головки и т.п.) в органах и тканях, пораженных грибами. С этой целью готовят гистологические тонкие или ультратонкие срезы тканей, окрашивают их специальными гистологическими и гистохимическими методами и исследуют с применением световой, а в случае необходимости и электронной микроскопии.

15.5.4. Особенности микробиологической диагностики протозойных инфекций

Микроскопическое исследование патологического материала заключается в приготовлении как нативных препаратов («толстая капля»), так и мазков, окрашенных по методу Романовского- Гимзе, и является основным методом диагностики заболеваний, вызванных простейшими. В некоторых случаях применяют серологический и аллергологический методы диагностики.

15.6. Принципы иммунологической диагностики болезней человека

Иммунодиагностика — раздел иммунологии, изучающий и разрабатывающий методы диагностики инфекционных и неинфекци- онных болезней, связанных с функцией иммунной системы.


Многие инфекционные заболевания в настоящее время претерпели существенные изменения, что выражается в увеличении удельного веса легких, стертых и бессимптомных форм, росте аллергического компонента, высокой частоте микст-инфекций. Это затрудняет традиционную диагностику заболеваний, поэтому значимость иммунодиагностики, направленной на поиск антигенов возбудителя или специфических иммунных сдвигов в организме больного, возрастает.

Под иммунореактивностью (иммунный статус, иммунный профиль) понимают способность иммунной системы к иммунному ответу в данный момент времени. Ее характеризуют концентрация иммуноглобулинов, количество лимфоцитов и лейкоцитов, соотношение Т- и В-клеток и функциональные показатели, в частности способность иммунокомпетентных клеток отвечать на стимуляцию.

15.7. Контроль качества лабораторных исследований

Важным элементом работы микробиологической и иммунологической лаборатории является получение точных и сопоставимых результатов анализов, для чего необходимо осуществлять контроль качества проводимых исследований. Контроль качества может быть внутрилабораторным и внешним.

Внутрилабораторный контроль качества — система контрольных мер, которые проводятся в отдельной лаборатории персоналом этой лаборатории и направлены на обеспечение соответствующего качественного уровня работы лаборатории.

Внешний контроль качества — система контрольных мер, которые проводятся в рамках единой Федеральной системы внешней оценки качества (ФСВОК) лабораторных исследований группами экспертов и направлены на обеспечение правильной организации технологических процессов производства лабораторных исследований.

Федеральная система внешней оценки качества лабораторных исследований состоит из разделов, в рамках каждого из которых

выполняется оценка качества определенного вида лабораторных исследований. В структуру ФСВОК входят экспертные группы по разработке и проведению внешнего контроля качества в различных видах лабораторных исследований.

Задания для самоподготовки (самоконтроля)

A. Назовите метод микробиологического исследования, позволяющий установить вид возбудителя:

Б. Назовите основную задачу бактериологического метода исследования.

B. У больного с подозрением на вирусную инфекцию на 7 день заболевания была взята сыворотка, в которой обнаружены специфические противовирусные антитела. Оцените достоверность полученного результата исследования.

Г. Назовите тип лаборатории, в которую следует направить материал от больного с подозрением на особо опасную инфекцию.

Оглавление темы «Методы обнаружения микроорганизмов. Микробиологическое исследование.»:

Серологические методы исследований выявления специфических AT и Аг возбудителя — важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможным. При этом необходимо выявить повышение титров AT, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 сут (иногда этот интервал может быть более длительным). AT обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов Ig чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием, Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.

Аллергологические методы исследования

Антигены многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутри-кожное введение Аг (аллергена) с развитием реакции ГЗТ. Кожные пробы нашли применение в диагностике таких заболеваний как сап, мелиоидоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту, используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.

Всем больным, страдающим атопическим дерматитом, должно быть как можно раньше проведено аллергологическое обследование, которое практически не имеет противопоказаний, за исключением обострения основного или других заболеваний. Диагностику следует проводить также в случае наличия у пациента других «аллергосимптомов» (эпизоды персистирующего кашля, в том числе ночью, после физической нагрузки; зуд и отек глаз и/или заложенность носа, насморк и т. п.). Аллергологическое обследование является обязательным для тех больных, которым предполагается назначить профилактическое лечение (специфическую иммунотерапию/аллерговакцинацию).

В целом аллергодиагностика имеет неоценимо важное значение с целью:
а) ранней идентификации детей из группы риска развития аллергических заболеваний;
б) назначения больному специфической терапии, в том числе элиминационной, соответствующей фармакотерапии, специфической иммунотерапии (аллерговакцинации).

У детей объем аллергологического обследования зависит от их возраста, семейной отягощенности атопией, провоцирующих факторов, симптомов заболевания и т.

п. История болезни включает данные о наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям, погрешностях в питании беременной/кормящей матери, профессиональных вредностях у родителей, сроках введения прикорма и реакций на новый вид пищи у ребенка. Врач тщательно анализирует частоту и тяжесть симптомов заболевания, факторы окружающей среды (жилищно-бытовые условия, наличие животных, птиц, рыб в квартире, курение и т. д.), уточняет связь клинических проявлений с определенным сезоном года, местом пребывания ребенка (школа, вне дома); выявляет другие сопутствующие атопические заболевания (пищевая аллергия, аллергический ринит/конъюнктивит, бронхиальная астма). Особое внимание обращают на специфический аллергологический анамнез, который необходимо использовать для дальнейшей коррекции противоаллергической терапии, а также на аллергологический анамнез тех больных, у которых были выявлены позитивные кожные пробы. Врачи могут пользоваться также стандартным аллергологическим опросником.

Атопию (или IgE-сенсибилизацию) устанавливают на основании клинических симптомов заболевания и положительных кожных проб или повышенного уровня общего или специфических IgE-антител в сыворотке крови больного.

При назначении детям, страдающим атопическим дерматитом, кожных проб необходимо учитывать следующее:
в случае обострения заболевания и при локальном применении наружных кортикостероидов применение кожных проб ограничено;
следует отменить прием антигистаминных препаратов за 3 дня до постановки кожных тестов;
рекомендуется постановка кожных проб с использованием прик-метода. По мнению зарубежных исследователей, считается ошибочной рекомендация ограничить их постановку у детей до 3 лет. Результаты прик-тестов в значительной степени зависят от используемого экстракта и давления ланцета на кожу;
атопия считается доказанной при наличии хотя бы одной положительной пробы (средний диаметр папулы > Змм при негативном контроле) или > 2 баллов при серологическом обследовании.

По положительным результатам аллергологического обследования можно говорить лишь о том, что индивид сенсибилизирован. Эти данные приобретают высокую диагностическую значимость только при сопоставлении с историей болезни и клиническими симптомами. Сравнительный анализ чаще всего подтверждает наличие у больных атопией строгой корреляции между высоким уровнем специфических IgE-антител сыворотки крови и клиникой заболевания. Применительно к атопическому дерматиту результаты кожного аллергологического обследования зависят от возраста ребенка, используемых методов диагностики и степени тяжести заболевания.

У детей в возрасте до 3-4 лет одним из основных провоцирующих факторов развития атопического дераматита считается пищевая аллергия. В раннем возрасте чаще всего она проявляется кожными и гастроинтестинальными симптомами, крайне редко — респираторными. Основная причина пищевой гиперчувствительности — аллергия на белки коровьего молока, яиц, злаки и орехи. Дети с дермо-респираторным синдромом могут быть сенсибилизированы к ингаляционным аллергенам, и их необходимо обследовать на пылевые клещи, шерсть кошки (чаще всего).

С возрастом повышается сенсибилизация к ингаляционным аллергенам (клещи домашней пыли, аллергены животных, тараканы), позже — к внежилищным аллергенам (грибки, пыльца). Как правило, высокую частоту сенсибилизации выявляют у детей с атопической астмой и аллергическим ринитом/конъюнктивитом. Однако наболее высокий уровень сывороточного IgE отмечается у больных атопическим дерматитом по сравнению с поллинозом или бронхиальной астмой.

Типичный сезонный ринит и/или конъюнктивит (весной, летом) можно диагностировать без аллергологического обследования только на основании анамнеза больного. В дальнейшем таким пациентам обязательно проводят аллергологическое обследование с целью уточнения причинно-значимых аллергенов и назначения специфической иммунотерапии.

Аллергический метод исследования в микробиологии

Цель микробиологического исследования — установить этиологическую роль тех или иных микроорганизмов при возникшем заболевании или клиническом синдроме. При этом следует учитывать, что возбудителями воспалительных процессов органов репродуктивной системы могут быть как УПМ — представители транзиторного компонента нормальной микрофлоры влагалища и других биотопов, так и абсолютные патогены — возбудители ИППП. Такая связь ИППП и оппортунистических инфекций (вызванных УПМ) определяет необходимость комплексного подхода к микробиологической диагностике.

ПОКАЗАНИЯ

Микробиологические методы исследования используют для подтверждения или исключения заболеваний инфекционной природы.

МЕТОДИКА

ПРАВИЛА ВЗЯТИЯ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Отделяемое из уретры берут пластиковой одноразовой стерильной бактериологической петлёй объёмом 1 мкл или тонким дакроновым тампоном на алюминиевой проволоке. Предварительно наружное отверстие уретры следует очистить марлевым или ватным тампоном. При отсутствии видимых выделений врач может выполнить лёгкий массаж уретры. Тампон/петлю вводят в уретру на 1–2 см и вынимают, слегка нажимая на боковые и заднюю стенки. Для микроскопического и иммунофлюоресцентного исследования материал переносят на предметное стекло, прокатывая по нему тампон или передвигая петлю с материалом с лёгким нажимом. Для культурального исследования и ПЦР материал помещают в пробирки с соответствующими транспортными средами.

Наружные половые органы, преддверие влагалища: мазки берут стерильными ватными (дакроновыми) тампонами с патологически изменённых участков; при воспалении большой железы преддверия проводят пункцию, при вскрытии абсцесса железы берут гной стерильным ватным тампоном.

Влагалище: после введения зеркала и подъёмника отделяемое берут стерильным ватным тампоном из заднего свода или с патологически изменённых участков слизистой оболочки; с целью культурального исследования тампон помещают в стерильную пробирку и немедленно отправляют в лабораторию. Если это требование не может быть выполнено, взятую пробу помещают в пробирку с транспортной средой.

С целью микроскопии взятую пробу переносят на предметное стекло, перекатывая тампон всеми сторонами по стеклу, стараясь, чтобы материал распределился равномерно, сохраняя естественное взаиморасположение всех компонентов биоценоза; мазок высушивают на воздухе, фиксируют 96% раствором этанола (2–3 капли на мазок до полного испарения), маркируют стекло и в закрытой ёмкости отправляют в лабораторию. При культуральной диагностике трихомониаза взятое отделяемое сразу помещают в питательную среду и транспортируют в лабораторию.

Шейка матки: после обнажения шейки матки в зеркалах влагалищную часть её тщательно обрабатывают ватным тампоном, смоченным стерильным 0,9% раствором натрия хлорида или водой, затем стандартный ватный тампон осторожно вводят в шеечный канал, берут отделяемое, вынимают тампон, не касаясь стенок влагалища, и помещают его в пробирку с транспортной средой для проведения культурального исследования. Для выполнения микроскопии методом иммунофлюоресценции в различных модификациях, вирусологического исследования или ПЦР материал берут специальным тампономщёточкой, который вводят в канал после удаления слизистой пробки или взятия пробы на культуральное исследование. После введения тампонащёточки в цервикальный канал на 1–2 см его вращают несколько раз, чтобы получить клеточный соскоб, но не допуская скарификации и попадания элементов крови на тампон. Взятый материал помещают в пробирки с соответствующей транспортной средой. Для микроскопического и иммунофлюоресцентного исследования взятую пробу сразу переносят с тампона на предметное стекло.

Матка: материал из полости матки для исследования может быть получен только при использовании специального устройства, имеющего наружное покрытие на шприцеаспираторе. Соблюдая правила асептики, проходят цервикальный канал и в полости матки раскрывают наружную оболочку шприца, после чего аспирируют содержимое. После этого закрывают наружную оболочку и вынимают зонд из матки.

Придатки матки: материал из очага инфекции можно получить только при оперативном вмешательстве (гной, экссудат, биопсийный материал) или при проведении диагностической пункции опухолевидных образований в малом тазу, проводимой через влагалищные своды (следует учитывать возможность контаминации пробы влагалищной микрофлорой). В некоторых случаях, если очаг инфекции в придатках матки сообщается с полостью матки, могут быть полезными повторные исследования отделяемого цервикального канала при однотипности результатов исследования. Моча: после тщательного туалета наружных половых органов в стерильный контейнер собирают среднюю порцию утренней свободно выпущенной мочи в количестве 5–10 мл. Учитывая, что содержащиеся в моче микроорганизмы при комнатной температуре начинают размножаться, образец должен быть доставлен в лабораторию в течение 1–2 ч, чтобы избежать ложных результатов при количественной оценке степени бактериурии. При невозможности выполнить это требование допускают хранение пробы мочи при температуре 4 °С в холодильнике не более 12 ч.

Кровь: посев крови (выявление бактериемии) необходим при подозрении на развитие синдрома системного воспаления. Стойкая гипертермия, озноб, гипотермия, лейкоцитоз, признаки полиорганной дисфункции служат категорическими показаниями для микробиологического исследования крови. Пробы крови берут как можно раньше, от начала лихорадки 2– 3 раза с интервалом 30–60 мин из периферических вен верхних конечностей (взятие крови на высоте лихорадки не повышает чувствительности метода, более важным для выявления этиологии заболевания становится оптимальный объём взятой крови). Оптимально использование стандартных коммерческих флаконов с готовыми питательными средами для культивирования аэробных микроорганизмов и строгих анаэробов. Особое внимание к соблюдению правил асептики: кожу в месте венепункции обрабатывают 1–2% раствором йода или повидонйода движениями от центра к периферии в течение не менее 1 мин. После обеззараживания пальпация места венепункции недопустима. Непосредственно перед пункцией вены кожу обрабатывают 70% раствором этанола. Манипуляцию проводят в стерильных перчатках. С флаконов снимают пластмассовые крышечки, резиновые пробки протирают 70% раствором этанола. После взятия крови из вены меняют иглу и, прокалывая резиновую пробку, вносят кровь во флакон (в каждый из двух флаконов около 10 мл крови). У детей до 1 года берут 0,5–1,0 мл крови в один флакон. У детей от 1 года до 6 лет общий объём забираемой крови составляет 1 мл на каждый год жизни, и этот объём распределяют между двумя флаконами. У детей и взрослых с массой тела от 30 до 80 кг 10–20 мл крови распределяют между двумя флаконами.

Взятие одной пробы из периферической вены, а другой из катетера допустимо только в исключительных случаях: при необходимости выявить катетерассоциированную бактериемию или при объективных трудностях, связанных с проведением венепункции.

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ

Важный этап микробиологического исследования как при диагностике ИППП, так и оппортунистических инфекций. Позволяет дать предварительную оценку качественному и количественному составу микрофлоры в патологическом очаге, оценить качество взятия материала (соответствие его очагу воспаления, например присутствие вагинального эпителия в мазках, взятых из цервикального канала, свидетельствует о нарушении правил отбора биопробы), а также выявить микроорганизмы, не растущие на обычных питательных средах (гонококки, трихомонады, строго анаэробные бактерии).

Чувствительность метода световой микроскопии находится на уровне выявления микроорганизмов в количестве 4– 5 lg КОЕ/мл и более. Поэтому этиологически значимые микроорганизмы в ряде случаев могут быть обнаружены уже при микроскопии. Это в первую очередь относится к строго анаэробным бактериям, обычно с низкими патогенными возможностями, их этиологическая роль проявляется при высоком количественном уровне после накопления в очаге инфекции. Учитывая своеобразие морфологии многих видов строгих анаэробов (бактероидыпревотеллы, фузобактерии, мобилункус, вейлонеллы, лептотрихии), а также микроаэрофила гарднереллы, обнаружение их в окрашенных по Граму мазках отделяемого влагалища служит доказательством их этиологической роли. Принципиально важной становится микроскопия мазков вагинального отделяемого при диагностике бактериального вагиноза и других вагинальных инфекций.

Однако большинство факультативно анаэробных УПМ не имеют морфологического своеобразия, а степени их патогенности и чувствительность к антибиотикам, напротив, чрезвычайно разнообразна. Поэтому для этой группы УПМ становится необходимым культуральное исследование. Кроме диагностики бактериального вагиноза, микроскопический метод имеет преимущество перед культуральным исследованием при диагностике относительно редких в репродуктивном возрасте состояний вагинальной микроэкологии: цитолитического вагиноза, промежуточной формы микроценоза, вагинальной эпителиальной атрофии (последняя характерна для возраста менопаузы).

Диагностика кандидозного вульвовагинита чаще всего может быть осуществлена при микроскопии мазка отделяемого влагалища по обнаружению в окрашенных или нативных мазках элементов гриба: почкующихся дрожжевых клеток, фрагментов псевдомицелия с бластоспорами. Обнаружение в мазках элементов гриба свидетельствует об их большом количестве (более 4–5 lg КОЕ/мл) и чаще всего сопровождается выраженной лейкоцитарной реакцией в вагинальном мазке и клиническими проявлениями воспалительного процесса во влагалище, что достаточно для подтверждения клинического диагноза вагинального кандидоза.

При лабораторной диагностике гонореи в первую очередь проводят микроскопию мазков, взятых из уретры и цервикального канала (если нет показаний для обследования других локусов: глотки, конъюнктив, прямой кишки). Следует стараться сделать параллельно по 2 мазка из каждого локуса для окраски синькой и по Граму. Для острой гонореи характерно отсутствие или скудное количество представителей нормальной микрофлоры (лактобацилл), большое количество нейтрофильных лейкоцитов и наличие грамотрицательных диплококков, расположенных внутри лейкоцитов (с явлением незавершённого фагоцитоза) и вне лейкоцитов. Для хронической гонореи характерно наличие разнообразной микрофлоры наряду с грамотрицательными диплококками вне и внутри лейкоцитов и большое количество нейтрофилов. Чаще всего диагноз гонореи может быть установлен на основании микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Однако у беременных, подростков и детей обязательно культуральное исследование с видовой идентификацией Neisseria gonorrhoeae для дифференцирования от непатогенных нейссерий, которые признают компонентом нормальной влагалищной микрофлоры у девочек, а в случаях взятия материала из ротоглотки следует помнить о большом количестве видов непатогенных нейссерий в этих мазках в любом возрасте.

Микроскопический метод остаётся в настоящее время основным в диагностике урогенитального трихомониаза. Проводят исследование нативного препарата и/или окрашенного мазка. При микроскопии нативного препарата важно помнить, что исследованию подлежит свежевзятый материал (отделяемое уретры, влагалища) — в препарате выявляют живые, подвижные трихомонады. Для этого готовят препарат по методу «раздавленной» капли (взятое отделяемое с добавлением тёплого, близкого к температуре тела 0,9% раствора натрия хлорида накрывают покровным стеклом) или «висячей» капли (суспензию из взятых выделений помещают в лунку предметного стекла) и микроскопируют при увеличении в 400 раз при опущенном конденсоре. Из этого же материала готовят препараты для окраски метиленовым синим, по Граму или по Романовскому–Гимзе. Диагноз устанавливают на основании выявления в мазках типичных форм влагалищных трихомонад.

При оценке результатов микроскопии влагалищных мазков следует обращать внимание на следующие моменты:

  • состояние вагинального эпителия: преобладают клетки поверхностного, промежуточного или парабазального слоя; наличие так называемых «ключевых» клеток — поверхностных эпителиальных клеток, густо покрытых адгезированными на них мелкими грамвариабельными палочками, скрывающими границы клетки (рис. 6-1), или «ложноключевых» клеток — повышенная адгезия на эпителиальных клетках грамположительных палочек, чаще всего лактобацилл (рис. 6-2);
  • лейкоцитарную реакцию: её наличие, степень выраженности, проявления фагоцитоза, его завершённость;
  • состав микрофлоры: количественная и качественная оценка по морфотипам и тинкториальным свойствам.

Рис. 6-1. «Ложноключевые» клетки (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

Рис. 6-2. Нормоценоз (микроскопия мазка, окрашенного по Граму). Оценку общей микробной обсеменённости проводят по 4-балльной системе (критерии Nugent, несколько видоизменённые нами) — по числу микробных клеток, обнаруживаемых в одном поле зрения при микроскопии с иммерсией:

+ — до 10 микробных клеток в поле зрения — минимальное количество;
++ — от 11 до 100 микробных клеток в поле зрения — умеренное количество;
+++ — от 100 до 1000 микробных клеток в поле зрения — большое количество;
++++ — более 1000 микробных клеток в поле зрения — массивное количество.

Качественная оценка микрофлоры влагалища включает дифференциацию всех морфотипов по их тинкториальным свойствам и морфологическим признакам. Различают морфотипы лактобацилл, фузобактерий, бактероидов, мобилункусов, лептотрихий, вейлонелл, гарднерелл, а также грамположительных кокков, колиформных палочек, дрожжевых грибов. В мазке могут быть обнаружены трихомонады и другие паразиты.

При подозрении на сифилис не потеряли своего диагностического значения тёмнопольная микроскопия отделяемого эрозий и язв и метод прямой иммунофлюоресценции с использованием АТдиагностикумов к Т. pallidum. Эти методы используют в случаях с клиническими проявлениями на коже и слизистых оболочках, подозрительными на сифилис. Кроме того, препараты для микроскопии можно приготовить из пунктатов регионарных лимфатических узлов, спинномозговой жидкости, амниотической жидкости. Эрозивноязвенную поверхность осторожно (чтобы не получить кровотечения) очищают с помощью марлевого тампона, увлажнённого 0,9% раствором натрия хлорида, затем, осторожно сжимая и разжимая двумя пальцами основание язвы/эрозии, стимулируют выделение серозного экссудата, который берут бактериологической петлёй или аккуратно прикладывая к эрозивной поверхности предметное стекло. Полученное серозное отделяемое смешивают с равным количеством 0,9% раствора натрия хлорида, накрывают покровным стеклом и микроскопируют нативный препарат для обнаружения возбудителя по ряду характерных морфологических признаков и виду движений. Требуется определённый опыт, чтобы дифференцировать при микроскопии бледную трепонему от трепонемкомменсалов урогенитального тракта.

Более объективной может быть диагностика при микроскопии препаратов с помощью прямой иммунофлюоресценции. В этих случаях взятое на предметное стекло отделяемое из любых тканевых жидкостей, поверхностей патологических участков (в том числе аутопсийного материала) высушивают на воздухе, фиксируют этанолом или метанолом. После этого на препарат наносят специфический к Т. pallidum антитрепонемный глобулин. При микроскопии препарата возбудитель выявляют по яркозелёной специфической флюоресценции.

Иммунолюминесцентный метод — основной и в лабораторной диагностике ГГ, при этом в препарате из патологического материала выявляют Аг вируса. Обычно используют метод прямой иммунофлюоресценции, позволяющий определять как оба типа ВПГ, так и отдельно серотипы ВПГ1 и ВПГ2. Чувствительность и специфичность метода зависят от качества используемых диагностикумов. Материалом для исследования обычно служат жидкость из вскрытых пузырьков, отделяемое эрозивных поверхностей кожи и слизистых оболочек или соскоб со стенок цервикального канала (при латентной форме инфекции). Материал берут бактериологической петлёй или специальным тампоном и переносят на предметное стекло.

При урогенитальном хламидиозе выявление Аг хламидий с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии служит одним из ведущих лабораторных методов диагностики. Обычно используют прямую иммунофлюоресценцию, при проведении которой применяют моноклональные АТ к разным Аг хламидий — липополисахаридному (групповому), основному белковому видовому Аг наружной мембраны хламидий, а также АТ к рекомбинантным Аг хламидий. Качество диагностикумов определяет степень чувствительности метода. Большое значение при оценке результатов прямой иммунофлюоресценции имеет качество взятия материала: в мазке на стекле пробы, взятой из цервикального канала, должны присутствовать цилиндрические эпителиальные клетки и отсутствовать клетки плоского эпителия, эритроциты и лейкоциты. Результат считают положительным, если в мазках отделяемого с помощью люминесцентного микроскопа на оранжевокоричневом фоне эпителиальных клеток обнаруживают не менее 5 элементарных телец при увеличении 100 крат. Изза возможных ложноположительных результатов этот метод не рекомендуют для исследования материалов, полученных из носоглотки и прямой кишки.

КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Метод посева и выделения чистых культур возбудителей заболевания служит «золотым стандартом» микробиологической диагностики. Культуральное исследование наряду с микроскопией — основной метод при диагностике гонореи, трихомониаза, хламидиоза. Методы молекулярнобиологического исследования пока недостаточно специфичны для выявления этих возбудителей ИППП, чтобы вытеснить классические методы, но, несомненно, им принадлежит будущее. Другая ситуация сложилась с оппортунистическими инфекциями половых путей, число которых в эру антибиотиков и урбанизации жизни общества неуклонно увеличивается, динамично меняется их этиологическая структура и чувствительность к антибиотикам. Частая антибиотикорезистентность этих микроорганизмов становится причиной неэффективности лечения, поэтому адекватный выбор рациональной этиотропной терапии в современных условиях признают постоянной клинической проблемой.

Известно, что возбудителями воспалительных процессов половых органов могут быть разнообразные УПМ, в норме входящие в состав транзиторного компонента индигенной (нормальной) микрофлоры влагалища и прилегающих биотопов. Их патогенные свойства проявляются лишь в определённых условиях нарушения иммунного гомеостаза макроорганизма и местной колонизационной резистентности. В этих условиях микробиологическая диагностика должна учитывать возможную этиологическую роль широкого круга патогенов, а не только какоголибо конкретного возбудителя, как при диагностике классических инфекционных заболеваний, вызываемых абсолютными патогенами. Задачей исследования становится не только идентификация микроорганизмов, обнаруженных в патологическом материале, но и обоснование их этиологической роли в воспалительном процессе у данной больной. Поэтому при посеве клинического материала, особенно из локусов, и в норме имеющих микрофлору, очень важно использовать наиболее универсальные питательные среды, которые пригодны для культивирования широкого круга микроорганизмов. При этом необходимо учитывать количественные соотношения роста различных видов микроорганизмов в первичном посеве, так как истинному возбудителю чаще всего принадлежит превалирующая роль среди ассоциантов. Однако есть виды, которые и в небольшом количестве проявляют патогенные свойства (стрептококки групп А и В, протеи, клебсиеллы, золотистый стафилококк, листерии и др.).

Микробиологическая диагностика оппортунистических инфекций влагалища базируется на интегральной оценке результатов микроскопического и культурального исследований. При этом строго анаэробный компонент микрофлоры оценивают по микроскопии граммазков — большое количество анаэробных морфотипов, выявляемых при световой микроскопии (их количество в отделяемом влагалища превышает 6 lg КОЕ/мл), свидетельствует об их этиологической роли. При этом определение чувствительности анаэробов к антибиотикам в настоящее время не имеет клинической целесообразности, так как в подавляющем большинстве они высокочувствительны к антибиотикам с антианаэробной активностью (клиндамицин, метронидазол).

Напротив, что касается факультативноанаэробных и аэробных микроорганизмов, то диагностическая ценность микроскопического исследования вагинального отделяемого значительно снижается. Это связано, вопервых, с тем, что патогенные возможности этих бактерий могут проявляться при сравнительно небольшом (3–5 lg КОЕ/мл) их количестве, которое не выявляют при микроскопии. Вовторых, даже если морфотипы факультативноанаэробных бактерий обнаруживают в граммазках, морфологически они однотипны у многих видов и родов бактерий (это колиформные палочки или грамположительные кокки). В то же время их патогенные свойства и чувствительность к антибиотикам могут быть весьма разнообразными. Поэтому для характеристики факультативноанаэробной части микроценоза, а также микроаэрофилов (в первую очередь лактобацилл), которые по морфологии могут быть сходными с многими видами облигатноанаэробных бактерий (клостридии, эубактерии, пропионибактерии и др.), необходимо культуральное исследование — посев вагинального отделяемого. Для этих целей используют 5% кровяной агар (наиболее универсальная среда для большинства УПМ), агар Сабуро (для выделения грибов), среду МРС (для культивирования лактобацилл).

Результаты культурального исследования дают возможность оценить видовой состав и количественное соотношение различных видов в ассоциации микроорганизмов, в том числе грибов, а также лактобацилл, и тем самым подтвердить принадлежность к роду лактобацилл тех лактоморфотипов, которые были обнаружены при микроскопии граммазков. Выделение из патологического материала и идентификация различных видов семейства Enterobacteriaceae, стафилококков, стрептококков, неферментирующих бактерий, нейссерий, коринебактерий, грибов и других микроорганизмов после количественной оценки их роста позволяет определить степень их этиологической значимости в развитии вагинита у конкретной пациентки.

Кроме того, в случаях когда диагноз бактериального вагиноза установлен при микроскопии грамотрицательного мазка, результаты посева могут выявить повышенные титры УПМ (грибы, энтерококки, колиформные и другие бактерии), которые могут стать причиной осложнений после этиотропной терапии препаратами с антианаэробной активностью. Особенно следует иметь в виду микроорганизмы, которые даже в низких концентрациях служат фактором повышенного риска для внутриутробного плода (листерии, стрептококки групп А и В).

Методы идентификации нуклеиновых кислот

Методы выявления ДНК и РНК-возбудителей в настоящее время применяют в основном для диагностики вирусных инфекций. Методы генной диагностики базируются на выявлении нуклеотидных последовательностей непосредственно в патологическом материале с помощью молекулярных зондов — искусственно полученных нуклеиновых кислот, комплементарных вирусным нуклеиновым кислотам и меченных биотином или радиоактивной меткой.

Особенность метода ПЦР — многократное копирование (амплификация, репликация) с помощью фермента ДНКполимеразы определённого фрагмента ДНК, состоящего из нескольких десятков или сотен нуклеотидных пар, который уникален, то есть специфичен для данного вида вирусавозбудителя. Механизм репликации таков, что достраивание фрагмента может начаться только в определённых стартовых блоках, для создания которых в заданных участках ДНК
используют затравки (праймеры) — специально синтезированные олигонуклеотиды. Праймеры комплементарны последовательностям в пределах границ специфического фрагмента, и синтез ДНК протекает только в этих границах.

Процесс ПЦР заключается в большом числе циклов синтеза (амплификации) специфического фрагмента ДНК, накоплении большого числа копий, которые затем могут быть выявлены обычными методами детекции (иммунофлюоресцентный анализ, электрофорез).

Преимущества ПЦРдиагностики:

●простота исполнения;
●возможность полной автоматизации;
●быстрота получения результата;
●малое количество патологического материала, необходимого для исследования;
●возможность диагностики острых, хронических, латентных инфекций;
●выявление некультивируемых, персистирующих форм патогенов.

По чувствительности ПЦР наиболее совершенен как диагностический метод (на несколько порядков выше, чем другие тесты). Специфичность метода также высока, но пока большинство тестсистем недостаточно надёжны, чтобы вытеснить классические методики при диагностике даже абсолютных патогенов.

Что касается оппортунистических инфекций, то значение молекулярно-генетических методов диагностики пока нельзяпризнать сколько-нибудь значимыми, так как определяющим моментом в развитии таких воспалительных процессов служит количественный фактор, а не само по себе присутствие микроорганизма в обследуемом локусе.

В настоящее время ПЦР-методы широко используют в диагностике вирусных, паразитарных и бактериальных ИППП, чаще в качестве первичного скрининга, а также контроля излеченности в сочетании с другими методами лабораторной диагностики. С помощью новейших технологий, таких как ПЦР в режиме реального времени и метода NASBA, можно определить точное количество вируса у ВИЧпациентов.

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Методы, выявляющие специфические АТ и Аг возбудителей. Важна их роль особенно в тех случаях, когда выделение возбудителя представляет значительные трудности. При выявлении специфических АТ необходимо установить повышение их титров, в связи с чем исследуют парные сыворотки с интервалом 2–3 нед. Определение классов иммуноглобулинов чётко характеризует этапы инфекционного процесса и в ряде случаев может служить прогностическим признаком его течения.

Большое значение имеют методы выявления Аг возбудителей. Их можно обнаружить уже на самых ранних этапах инфекционного процесса, что делает возможной экспрессдиагностику, а количественное определения Аг в динамике заболевания служит критерием эффективности проводимого лечения.

Ведущее значение приобрели серологические методы в диагностике сифилиса и ВИЧинфекции. В диагностике ВИЧинфекции обычно используют иммуноферментный анализ, позволяющий получить положительные результаты исследования уже через 1–1,5 мес после заражения. Положительные результаты скрининга с использованием иммуноферментного анализа требуют подтверждения методом иммуноблота, который позволяет верифицировать АТ к различным вирусным белкам.

При диагностике сифилиса в настоящее время используют разнообразные серологические методы, позволяющие выявлять в организме АТ к различным Аг детерминантам T. pallidum. В зависимости от используемого Аг серологические реакции делят на две группы: трепонемные и нетрепонемные. Первые используют для скрининга. Они технически просты в исполнении, не требуют много времени, возможен количественный вариант реакции с определением титра АТ, что позволяет использовать их для оценки эффективности проводимого лечения. Однако эти тесты не позволяют обнаружить АТ в первые 2–4 нед первичного сифилиса, а также возможны ложноположительные и ложноотрицательные реакции.

Трепонемные тесты обладают высокой специфичностью и позволяют подтвердить результаты нетрепонемных тестов. Но трепонемные тесты оказались недостоверными при исследовании спинномозговой жидкости (кроме реакции прямой гемагглютинации), их также не используют в качестве контроля эффективности лечения и не исключена возможность ложноположительных реакций.


При оппортунистических бактериальных инфекциях, возбудители которых имеют много общих Аг с тканевыми Аг организма хозяина и служат слабыми стимуляторами выработки специфических АТ, серологические методы диагностики практически не используют.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ОТДЕЛЯЕМОГО ЖЕНСКИХ ПОЛОВЫХ ОРГАНОВ

При оценке результатов микробиологического исследования отделяемого женских половых органов необходимо учитывать совокупность признаков в каждом конкретном случае: данные микроскопии первичных мазков исследуемого материала, результаты прямого посева на плотные питательные среды (количественная оценка роста различных видов), а также клиническую симптоматику заболевания и анамнез больной. Так, при исследовании материала из закрытых полостей (пунктаты опухолевидных образований в малом тазу, околоплодные воды), а также органов, в норме стерильных (содержимое полости матки, соскоб эндометрия, кусочки органов и тканей, удаляемых при оперативном вмешательстве), рост микроорганизмов, особенно в монокультуре, свидетельствует об их этиологической роли. При исследовании материала из локусов, и в норме имеющих разнообразную микрофлору, большое значение придают оценке видового состава, количественной оценке роста различных видов, выросших при первичном посеве, однотипности результатов при повторных исследованиях, а также клиническим данным. На основании интегральной оценки результатов микроскопии и культурального исследования отделяемого влагалища могут быть предложены следующие микробиологические критерии оценки состояния микроценоза влагалища по отдельным нозологическим формам у женщин репродуктивного возраста.

НОРМОЦЕНОЗ

  • Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 6-3):
    ♦вагинальный эпителий представлен клетками поверхностных слоёв, реже встречают клетки промежуточного слоя
    (соотношение может меняться в зависимости от фазы менструального цикла, у беременных много промежуточных клеток),
    «ключевые» клетки отсутствуют, иногда встречают «ложноключевые» клетки;
    ♦лейкоцитарная реакция отсутствует или слабо выражена — единичные лейкоциты в поле зрения;
    ♦общее количество микроорганизмов умеренное или большое;
    ♦доминирующий морфотип — лактобациллы, другие морфотипы либо отсутствуют, либо их количество исчисляется
    единичными микробными клетками в редких полях зрения.
  • Культуральное исследование:
    ♦общая микробная обсемененность — 6–8 lg КОЕ/мл;
    ♦абсолютное преобладание лактобацилл;
    ♦УПМ в низком титре (менее 3 lg КОЕ/мл) или отсутствуют.

Рис. 6-3. «Ключевые» клетки (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

БАКТЕРИАЛЬНЫЙ ВАГИНОЗ

  • Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 6-4):
    ♦вагинальный эпителий представлен клетками поверхностных слоёв, редко встречают промежуточные клетки, часто — «ключевые» клетки;
    ♦лейкоцитарная реакция, как правило, отсутствует;
    ♦общее количество микроорганизмов массивное, реже — большое;
    ♦преобладают морфотипы строгих анаэробов и гарднереллы, лактоморфотипы отсутствуют или определяются как единичные не во всех полях зрения.
  • Культуральный метод:
    ♦общая микробная обсеменённость превышает 9 lg КОЕ/мл; полимикробный характер микрофлоры с абсолютным преобладанием облигатно анаэробных видов и гарднереллы;
    ♦при использовании только аэробных условий культивирования рост микроорганизмов отсутствует или наблюдают рост УПМ, чаще в небольшом титре;
    ♦отсутствует рост лактобацилл или их титр резко снижен (менее 5 lg КОЕ/мл).

Рис. 6-4. Бактериальный вагиноз (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

ВАГИНАЛЬНЫЙ КАНДИДОЗ

В зависимости от концентрации грибов в отделяемом влагалища и сопутствующей микрофлоры можно выделить 3 формы кандидозной инфекции влагалища.

  • Микроскопия мазков, окрашенных по Граму (рис. 6-5):
    ♦вагинальный эпителий преимущественно поверхностных слоёв, но может быть много промежуточных и даже парабазальных клеток (пропорционально степени тяжести клинического течения заболевания);
    ♦лейкоцитарная реакция от умеренной (10–15 лейкоцитов в поле зрения) до резко выраженной (30–50 и более лейкоцитов в поле зрения);
    ♦общее количество микроорганизмов умеренное или большое;
    ♦доминируют морфотипы лактобацилл, присутствуют дрожжевые клетки, фрагменты псевдомицелия с бластоспорами.
  • Культуральный метод:♦общее количество микроорганизмов не превышает 8 lg КОЕ/мл;
    ♦дрожжевые грибы присутствуют в титре более 4 lg КОЕ/мл;
    ♦лактобациллы высевают в титре более 6 lg КОЕ/мл.

Рис. 6-5. Кандидозный вагинит (микроскопия мазка. окрашенного по Граму).

Сочетание бактериального вагиноза и кандидозного вагинита.

  • Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 6-6):
    ♦вагинальный эпителий преимущественно поверхностных слоёв, присутствуют «ключевые» эпителиальные клетки;
    ♦умеренная или выраженная лейкоцитарная реакция;
    ♦общее количество микроорганизмов массивное или большое;
    ♦доминируют морфотипы строгих анаэробов и гарднереллы, присутствуют дрожжевые клетки и/или фрагменты псевдомицелия гриба;
    ♦лактоморфотипы отсутствуют или видны единичные в поле зрения.
  • Культуральный метод:
    ♦общее количество микроорганизмов массивное (более 9 lg КОЕ/мл), но при культивировании только в аэробных условиях отмечают рост лишь дрожжеподобных грибов в умеренном или высоком титре (4–7 lg КОЕ/мл);
    ♦рост лактобацилл отсутствует или их титр низкий (менее 4 lg КОЕ/мл);
    ♦доминирующие в посеве микроорганизмы — бактероиды, превотеллы, гарднерелла, анаэробные кокки.

Рис. 6-6. Сочетание бактериального вагиноза и кандидозного вагинита (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

Бессимптомное носительство грибов.

  • Микроскопия мазка, окрашенного по Граму:
    ♦вагинальный эпителий представлен преимущественно клетками поверхностных слоёв;
    ♦лейкоцитарная реакция не выражена, единичные лейкоциты в поле зрения;
    ♦общее количество микроорганизмов умеренное или большое;
    ♦доминируют морфотипы лактобацилл, грибы чаще всего не выявляют или встречают в редких полях зрения единичные дрожжевые клетки.
  • Культуральный метод:
    ♦общее количество микроорганизмов не превышает 8 lg КОЕ/мл;
    ♦доминируют

НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ВАГИНИТ

Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 6-7):
♦вагинальный эпителий представлен поверхностными и промежуточными клетками, при выраженном воспалительном процессе встречают парабазальные клетки;
♦выражена в разной степени лейкоцитарная реакция (более 10 лейкоцитов в поле зрения);
♦общее количество микроорганизмов умеренное;
♦лактобациллы отсутствуют или их количество резко снижено (до единичных в поле зрения);
♦преобладают морфотипы УПМ — колиформные палочки или грамположительные кокки.

Культуральный метод:
♦отсутствие роста лактобацилл или их минимальное количество;
• рост факультативноанаэробных УПМ, чаще всего одного вида в высоком титре.

Рис. 6-7. Неспецифический вагинит (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

ПРОМЕЖУТОЧНЫЙ ВАРИАНТ МИКРОЦЕНОЗА

  • Микроскопия мазка, окрашенного по Граму:
    ♦вагинальный эпителий представлен поверхностными клетками, можно встретить единичные «ключевые» клетки или
    наблюдать склонность к их формированию;
    ♦количество лейкоцитов не более 10 в поле зрения;
    ♦общее количество микроорганизмов умеренное или большое;
    ♦доминируют морфотипы строгих анаэробов и гарднереллы в сочетании с умеренно сниженным титром лактобацилл.
  • Культуральный метод:
    ♦общее количество микроорганизмов 6–8 lg КОЕ/мл;
    ♦титр лактобацилл снижен, но может достигать умеренных величин (5–6 lg КОЕ/мл);
    ♦умеренный титр облигатных анаэробов и гарднереллы (5–7 lg КОЕ/мл).

ЦИТОЛИТИЧЕСКИЙ ВАГИНОЗ

  • Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 6-8):
    ♦эпителиальные клетки в подавляющем большинстве подвергнуты цитолизу; в мазке преобладают элементы деструкции
    клеток — детрит, обнажённые ядра поверхностных и промежуточных клеток;
    ♦лейкоциты отсутствуют или их количество не превышает 10 в поле зрения;
    ♦микрофлора в большом количестве, представлена морфотипами типичных лактобацилл.
  • Культуральный метод:
    ♦обильный рост только лактобацилл;
    ♦сопутствующая микрофлора, как правило, отсутствует.

Рис. 6-8. Цитолитический вагиноз (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

ВАГИНАЛЬНАЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНАЯ АТРОФИЯ

  • Микроскопия мазка, окрашенного по Граму (рис. 6-9):
    ♦в зависимости от степени атрофии слизистой оболочки влагалища эпителий представлен различным соотношением числа промежуточных и парабазальных клеток, по мере нарастания атрофии увеличивается число парабазальных и базальных клеток;
    ♦количество лейкоцитов обычно не превышает 10 в поле зрения;
    ♦микрофлора практически отсутствует; можно встретить единичные лактоморфотипы или морфотипы УПМ в редких полях зрения.
  • Культуральный метод:
    ♦низкая общая микробная обсеменённость (2–4 lg КОЕ/мл);
    ♦низкие титры как лактобацилл, так и УПМ.

Рис. 6-9. Вагинальная эпителиальная атрофия (микроскопия мазка, окрашенного по Граму).

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ

При выделении типичных патогенов (золотистый стафилококк, листерии, клебсиелла, другие колиформные бактерии, синегнойная палочка), а также грибов диагностическую значимость имеет даже одна положительная гемокультура. При выделении микроорганизмов, которые признаны кожными сапрофитами (коагулазоотрицательные стафилококки, дифтероиды, микрококки) для подтверждения истинной бактериемии требуется две положительные гемокультуры.

ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ МОЧИ

Степень бактериурии — главный критерий при дифференциации инфекционного процесса в мочевых путях от контаминации мочи нормальной микрофлорой. Степень бактериурии, не превышающая 3 lg КОЕ/мл, обычно результат контаминации. Степень бактериурии 3–4 lg КОЕ/мл расценивают как сомнительный результат и исследование необходимо повторить. Степень бактериурии, равная и выше 5 lg КОЕ/мл, указывает на наличие воспалительного процесса. Однако
необходимо учитывать особенности клинических проявлений заболевания и проводимую терапию (не только антибактериальную). Например, при плохом пассаже мочи, при её низкой относительной плотности, при рН встречают в моче здоровых людей. Монокультура чаще характерна для острых воспалительных процессов, и она сочетается с высокой степенью бактериурии. Ассоциации микроорганизмов чаще встречают при хронических процессах. При окончательной оценке результатов микробиологического исследования мочи необходимо учитывать данные клинической картины и других лабораторных исследований.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА РЕЗУЛЬТАТ

Достоверность микробиологической диагностики в первую очередь зависит от соблюдения врачомклиницистом правил взятия патологического материала для исследования и полноценности сведений о состоянии обследуемой пациентки, так как от этих данных зависят выбор тактики микробиологического исследования и интерпретация полученных результатов. Необходимо соблюдать следующие требования при взятии и транспортировке биоматериала для микробиологического
исследования:

●брать материал из очага инфекции (где возбудитель находится в максимальном количестве), а при невозможности выполнить это требование, брать биопробы, связанные с очагом инфекции (моча при патологии почек и мочевого пузыря, отделяемое из цервикального канала при эндометрите);
●отделяемое из влагалища, цервикального канала, уретры брать до проведения мануального влагалищного исследования; удостовериться, что пациентка не использовала местного лечения по крайней мере в течение последних 3 сут;
●брать материал до начала антимикробной терапии, а при невозможности выполнить это требование — непосредственно перед введением следующей дозы препарата (когда концентрация его становится минимальной);
●соблюдать правила асептики, т.е. не допускать контаминации забираемой пробы сопутствующей транзиторной микрофлорой;
●использовать для взятия пробы стерильные ватные (дакроновые) тампоны и транспортные среды (отделяемое влагалища, цервикального канала, раневое отделяемое), контейнеры (моча, кал), шприцы (гной, экссудат), флаконы с питательными средами для посева крови; для экспрессдиагностики вирусных инфекций используют тампоныщётки, с которых биоматериал переносят на предметное стекло или помещают в специальные транспортные среды;
●транспортировку в лабораторию взятого материала проводить в адекватном температурном режиме (20–37 °С), в максимально короткие сроки (не более 1–1,5 ч); при невозможности выполнить это требование использовать транспортные среды и хранить пробы в условиях бытового холодильника (за исключением ликвора и крови);
●при подозрении на анаэробную инфекцию материал следует максимально защищать от кислорода воздуха; сразу после взятия помещать в анаэробные контейнеры или в специальные транспортные среды;
●при подозрении на гонорейную инфекцию предпочтительнее прямой посев взятого стерильной пластиковой петлёй материала на плотную селективную среду; затем чашку Петри с посевом помещают в специальный пластиковый пакет с повышенным содержанием углекислого газа и отправляют в лабораторию.

Среди факторов, влияющих на достоверность микробиологической диагностики, можно выделить:

●условия взятия и транспортировки биологического материала;
●адекватный выбор методов микробиологического исследования;
●профессиональную квалификацию врачамикробиолога;
●полноценность сведений о состоянии обследуемой пациентки, важных с точки зрения оценки полученных результатов.

Необходимо постоянно поддерживать контакт с лабораторией, проводить совместные обсуждения клиницистов и микробиологов для оперативного снятия претензий и вопросов друг к другу, периодически проводить анализ, оценку работы для её совершенствования.

24. Аллергия, классификация аллергенов, особенности инфекционной аллернии

24. Аллергия, классификация аллергенов, особенности инфекционной аллернии

Аллергия – это состояние повышенной чувствительности организма к повторной сенсибилизации антигенами.

Аллергия возникает на повторное внедрение аллергена. Аллергены – это антигены, на которые в организме возникает аллергическая реакция. Аллергены могут иметь различное происхождение:

3) животного происхождения;

В основе аллергии могут лежать гуморальный и клеточный иммунный ответ. По механизмам и клиническим проявлениям выделяют четыре типа аллергии.

1. Анафилактический. Образуются комплексы АГ – АТ, которые фиксируются на различных клетках-мишенях, тучных клетках, базофилах, сенсибилизируя их к соответствующему аллергену. При повторном попадании аллергена в организм происходит выделение медиаторов аллергии.

2. Цитотоксический. При повторной сенсибилизации образующийся комплекс АГ – АТ ведет к цитолизу – гибели собственных клеток.

3. Иммунокомплексный. При повторном введении антигена избыток комплекса АГ – АТ приводит к мощной активизации комплемента.

4. Клеточный. В его основе преобладает клеточный иммунный ответ. За развитие реакции ответственны Т-киллеры. Развивается гиперчувствительность замедленного типа. Лежит в основе инфекционной аллергии.

Инфекционный аллерген – слабый аллерген, состояние аллергии развивается только в его присутствии.

Инфекционная аллергия развивается:

1) при хронической форме дизентерии, гонореи, туберкулезе, в третичном периоде сифилиса; при этом образуются гуммы – опухолеподобные разрастания лимфоидной ткани;

2) при особо опасных инфекциях: чуме, сибирской язве, туляремии, бруцеллезе;

3) при глубоких микозах;

4) в период реконвалесценции при тифопаратифозных заболеваниях.

При ряде инфекций может быть использован аллергологический метод диагностики,

1) при туберкулезе – проба Манту с туберкулином;

2) при хронической форме дизентерии – проба Цуверкалова;

3) при гонорее – проба с гоновакциной;

4) при бруцеллезе – проба Бюрне с бруцеллином;

5) при туляремии – проба с туляремином;

6) при сибирской язве – проба с антраксином.


Положительные аллергические пробы дают больные, бактерионосители и вакцинированные живой вакциной.

Микробиология

Предисловие

Микроорганизмы повсеместно распространены в природе, что является подтверждением их значимой роли в круговороте веществ биосферы и в жизни человека. Со времен седой древности и до наших дней человек использует деятельность микробов в ряде производственных процессов.

Специалисту биологу необходимо знать основы микробиологии, изучающей строение, жизнедеятельность, закономерности роста и развития микроорганизмов, их взаимодействие с внешней средой.

Микроорганизмы широко используются в пищевой промышленности в технологических процессах производства различных продуктов. На основе их жизнедеятельности основано производство кисломолочных продуктов, квашенных овощей, хлеба, вина и пива. От применения микроорганизмов в значительной степени зависят вкусовые качества пищевых продуктов. Микроорганизмы используются в получении многих биологически активных веществ: ферментов, витаминов, антибиотиков.

Однако наряду с полезной микрофлорой существует и группа патогенных микробов − возбудителей болезней человека. Многие из них являются возбудителями порчи различных пищевых продуктов. Микроорганизмы распространенны повсюду, этому способствуют их разнообразные потребности в пище, легкая приспособленность к условиям существования, высокая выносливость, способность к исключительно быстрому размножению.

ТЕМА № 1. Правила работы и устройство микробиологической лаборатории. Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препара

Знание и неукоснительное соблюдение правил работы с различными группами микроорганизмов являются гарантией отсутствия случаев внутрилабораторных заражений, а изучение техники приготовления микроскопических препаратов является основой микроскопического метода исследования.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ

Ознакомление студентов с устройством микробиологических лабораторий, изучение правил работы в них, освоение техники приготовления и микроскопического исследования окрашенных препаратов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Определение термина «микробиология». Задачи, достижения и проблемы данной научной сферы. Связь микробиологии с другими дисциплинами.
  2. Принципы организации и оборудование микробиологической лаборатории.
  3. Правила работы в микробиологической лаборатории.
  4. Простые и сложные методы окраски бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Содержать рабочее место в порядке.
  2. Микроскопировать препараты, обнаруживать внутриклеточные включения, капсулы, элементы бактериальной клетки.
  3. Работать с помощью иммерсионного объектива биологического микроскопа, с фазово-контрастной установкой и в темном поле.
  4. Приготовить мазок-препарат, окрашенный простым способом по методам Грама, Циля − Нильсена.
  5. Приготовить препараты для микроскопического исследования микроорганизмов в живом состоянии.

Организация микробиологической лаборатории

Микробиологические лаборатории — это лаборатории, в которых выполняют различные микробиологические исследования. Существуют 3 типа микробиологических лабораторий:

  • клинико-диагностические — при больницах, диспансерах и поликлиниках:
  • санитарно-бактериологические — при санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС);
  • ведомственные — при молочных, консервных заводах, мясокомбинатах, хлебозаводах, пивоваренных заводах, водонасосных станциях, станциях защиты растений и др.

Клинико-диагностические лаборатории проводят микробиологическую диагностику инфекционных болезней.

Лаборатории при СЭС осуществляют санитарный надзор на различных предприятиях, следят за санитарным состоянием помещений, оборудования, инвентаря, соблюдением правил личной гигиены персоналом, а на пищевых предприятиях — за соблюдением санитарных правил при технологической обработке, хранении, реализации, транспортировке пищевых продуктов.

Ведомственные лаборатории в зависимости от типа производства выполняют текущие анализы по внутрипроизводственному, входному и выходному контролю на микробную загрязнённость сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, занимаются разработкой методов, обеспечивающих микробиологическую безопасность производства.

Выполняя микробиологические исследования, необходимо соблюдать следующие правила:

  • с инфицированным материалом работают только с помощью инструментов (пинцетов, петель, корнцангов и др.);
  • прикасаться руками к исследуемому материалу и конденсату в засеянных чашках запрещается;
  • перед работой тщательно проверяют целость стеклянной посуды, проходимость игл и надежность поршней шприцев;
  • при посеве материала делают надпись на пробирках, чашках Петри, колбах, флаконах с названием номера анализа (культуры) и даты посева;
  • в пробирки и чашки Петри материал высевают вблизи от огня горелки с обжиганием петли, шпателя, краев пробирки;
  • во время работы все чашки с посевами помещают в кюветы или на подносы, пробирки − в штативы;
  • растворы, содержащие патогенные микроорганизмы, набирают пипеткой с помощью резинового баллона;
  • насасывать ртом и переливать растворы из сосуда в сосуд через край нельзя;
  • по окончании работы запрещается оставлять на рабочих столах нефиксированные мазки, чашки Петри, пробирки и другую посуду с инфицированным материалом;
  • не разрешается выходить за пределы лаборатории в халатах и надевать их на верхнюю одежду.

Доставлять инфицированный материал в лабораторию и переносить его из одной лаборатории в другую на территории учреждения нужно в специально приспособленной посуде (металлических биксах, ящиках, баках).

В комнатах, предназначенных для обработки и посева инфекционного материала, нельзя проводить другие работы, выращивать цветы, держать домашних животных.

Принимать пищу, пить, курить, хранить продукты питания в помещениях, в которых работают с материалом, зараженным патогенными микроорганизмами или подозрительным на такое заражение, запрещается.

Центрифугирование инфекционного материала проводит специально обученный персонал. Если в процессе центрифугирования разбивается пробирка, содержащая инфекционный материал, центрифугу отключают от сети, выжидают время для того, чтобы осели капли аэрозоля, дезинфицируют, а загрязненные места очищают.

Термостаты и термостатные комнаты, предназначенные для выращивания патогенных микроорганизмов, дезинфицируют не реже одного раза в месяц.

При хранении инфекционных материалов в холодильнике необходимо принимать меры, предупреждающие его инфицирование. Оттаивание холодильника, предусмотренное правилами эксплуатации, нужно совмещать с его дезинфекцией.

В лаборатории обязательно должна быть укомплектованная аптечка для экстренной медицинской помощи, включающая этиловый спирт, настойку йода, перевязочные средства, набор необходимых антибиотиков.

Использованные при лабораторных исследованиях предметные стекла, пипетки, шпатели погружают на сутки в банки с дезинфицирующим раствором, затем моют и кипятят.

Отработанные чашки Петри и пробирки с посевами культур, посуду с использованным материалом, собирают в банки с крышками и стерилизуют паром под давлением.

Бактерицидные лампы включают только в отсутствие персонала.

Руки тщательно моют с туалетным мылом, вытирают вафельным полотенцем и смазывают защитным питательным кремом.

Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски

В связи с малыми размерами большинства патогенных микроорганизмов (не более 2-30 мкм) изучение их морфологии возможно только с помощью специальных оптических приборов, получивших название микроскопы (от греч. микрос − малый и скопейн − рассматривать, наблюдать). Они дают значительное увеличение и обладают высокой разрешающей способностью, то есть наименьшим расстоянием между двумя точками, дающими в поле зрения раздельное изображение.

Разрешающая способность человеческого глаза превышает 80 мкм. Размеры патогенных микроорганизмов меньше указанной величины, поэтому мы их не видим. Более того, микроорганизмы, расположенные друг к другу ближе 80 мкм, раздельно не воспринимаются. Современные микроскопы позволяют получать раздельное увеличенное изображение микроорганизмов и других объектов и структур, не доступных невооруженному человеческому глазу.

В настоящее время в практике микробиологических исследований используют несколько типов микроскопов (биологический, люминесцентный, исследовательский, электронный) и специальные методы микроскопии (темнопольный, фазово-контрастный).

Биологический микроскоп

Для микроскопических исследований применяют биологические микроскопы отечественных моделей: БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ 17, БИОЛАМ С-11, БИОЛАМ П-1, БИОЛАМ И (микроскопы Р − рабочие, С − студенческие).

Современный биологический микроскоп — сложный оптический прибор, позволяющий изучать объекты в проходящем свете, в светлом и темном поле, а также в отраженном свете. Все эти микроскопы обеспечивают достаточно большое увеличение и высокую разрешающую способность (до 0,4 мкм).

Биологический микроскоп состоит из двух систем − механической и оптической (рис.1).

Механическая система микроскопа включает: штатив; колонку; тубус (съемный, наклонный − в современных моделях); подвижный предметный столик; макрометрический винт для грубой (ориентировочной) настройки на резкость; микрометрический винт, обеспечивающий тонкую фокусировку препарата; револьвер для объективов.

Оптическая система микроскопа содержит две части — осветительную и наблюдательную. Осветительная часть состоит из зеркала и конденсора с ирисовой апертурной диафрагмой. Зеркало имеет две отражательные поверхности — плоскую и вогнутую. С помощью конденсора лучи, идущие от зеркала, фиксируются и направляются на препарат. Яркость освещения регулируется ирисовой диафрагмой.

Рисунок 1. Устройство микроскопа: 1.окуляр, 2. насадка, 3. штатив, 4. основание, 5. револьверная головка, 6. объективы, 7. координатный столик, 8. предметный столик, 9. конденсор с ирисовой диафрагмой, 10. осветитель 11. переключатель (вкл./выкл.), 12. винт макрометрической (грубой) фокусировки, 13. винт микрометрической (точной) фокусировки

Оптическую часть микроскопа составляют объектив и окуляр. В микроскопах с наклонным тубусом имеется специальная призма, направляющая лучи под углом 45 0 к вертикали.

Объективы микроскопа отличаются сложным устройством и состоят из нескольких отдельных линз — фронтальной (нижней) линзы, увеличивающей объект, и коррекционных, исправляющих недостатки оптического изображения. Обычно применяют ахроматические объективы, в которых устранена хроматическая аберрация в отношении наиболее ярких цветов спектра (окрашивание изображения в различные цвета благодаря различной преломляемости лучей с различной длиной волны) и сферическая аберрация (нечеткое изображение периферических частей рассматриваемого предмета). Апохроматические объективы дают отчетливое, почти бесцветное изображение, поэтому они особенно эффективны при микрофотографировании (в них достаточно устранен остаточный хроматизм и достигнута равномерность резкости и величины изображения в лучах с разной длиной волны). Подобную оптику имеет БИОЛАМ Р-17 (объективы-апохроматы 10x, 20x, 60x, 90x МИ).

Объективы разделяют на сухие и иммерсионные (от лат. Immersio − погружение). Обычно биологические микроскопы оснащают двумя сухими объективами (8x и 40x) и одним иммерсионным (90x МИ), однако последние модели помимо указанных объективов оснащены более совершенной и разнообразной оптикой (БИОЛАМ Р-17 — апохроматами, БИОЛАМ И — планапохроматами ). Данные о каждом объективе обозначены на его оправе; к ним относятся: а) показатель увеличения x8, x40, x90; б) численная (нумерическая) аппертура; в) заводской номер объектива. Наряду с этими обозначениями иммерсионные объективы x90 (x100 БИОЛАМ И) имеют дополнительный буквенный индекс ОИ или МИ (объектив иммерсионный или микроскоп), а также черную маркировочную линию в нижней части объектива (рис.2).

Рисунок 2. Ход лучей в объективе с иммерсией: 1-иммерсионное масло n=1,515; 2- фронтальная линза иммерсионного объектива; 3- предметное стекло n=1,52

Фронтальная линза иммерсионного объектива имеет короткое фокусное расстояние — 1,5-3 мм. При микроскопии ее погружают в каплю предварительно нанесенного на препарат иммерсионного масла, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла — 1,52. При этом устраняются неизбежные потери света при попадании в объектив.

Окуляры состоят из двух линз: верхней − глазной и нижней − собирательной. На оправе окуляров обозначено увеличение: x5 (22 мм), x7 (18 мм), x10 (13 мм), x15 (11 мм). Окуляры подобны лупе и лишь увеличивают изображение, полученное объективом микроскопа.

Общее увеличение микроскопа определяют произведением увеличений объектива и окуляра. Например, увеличение микроскопа с иммерсионным объективом x90 и окуляром x10 составляет: 90 х 10 = 900 раз. Полезное увеличение микроскопа может достигать 1500 раз, в повседневной же практике обычно используют увеличение порядка 630-900 раз.

Для полного использования разрешающей способности микроскопа необходимо хорошо знать его устройство и, прежде всего, правильно осветить исследуемый объект. Освещение объектов может быть осуществлено естественным (дневным) или искусственным светом (БИОЛАМ Р-11, БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ С-11), во многих моделях микроскопов предусмотрено исследование объектов только при искусственном свете, так как они оснащены встроенным осветителем, в котором источником света являются лампы КГМН 6-30 (БИОЛАМ П-1), КГМ 9-70 (БИОЛАМ И) и КГМ 6-20 (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31). При повседневной работе целесообразно пропускать искусственный свет через матовый светофильтр конденсора.

В настоящее время фирмой «ЛОМО» (Санкт-Петербург) выпускаются так называемые микровизоры (рис. 3), то есть микроскопы, у которых вместо окуляра присутствует цветной телевизор, что дает, во-первых, возможность оцифровывать изображение на компьютере, а во-вторых, просматривать изображение одновременно нескольким лицам.

Рисунок 3. Микровизор

При работе с микроскопами, у которых встроенный источник света отсутствует, рекомендуется использовать следующие приемы в определенной последовательности.

  1. Подготовить микроскоп для работы: взять зеркало с плоской поверхностью (вогнутое зеркало применяют очень редко, как правило, при работе с объективами малых увеличений и без конденсора), конденсор поднять в верхнее положение до упора, диафрагму конденсора полностью открыть, поворотом револьвера включить сухой объектив (40х0,65), поставить матовый светофильтр.
  2. Исследуемый препарат установить на предметном столике и закрепить специальными клеммами.
  3. Повернуть зеркало таким образом, чтобы поле зрения микроскопа было освещено наиболее ярко.
  4. Поднимая или опуская тубус макрометрическим винтом, найти плоскость препарата и при необходимости рассмотреть его под малым увеличением.
  5. Поворотом револьвера включить иммерсионную систему (объектив 90х1,25) и на препарат нанести каплю иммерсионного масла.
  6. Под контролем глаза осторожно погрузить объектив в масло.
  7. Проверить освещенность поля зрения и наклоном зеркала улучшить освещенность препарата.
  8. Вращением макрометрического винта произвести грубую фокусировку изучаемого препарата.
  9. Детали исследуемого объекта рассмотреть, вращая микрометрический винт.
  10. Яркость освещения объекта отрегулировать только диафрагмой конденсора (не рекомендуют с этой целью менять положение конденсора). При смене препаратов операции с первой по пятую повторяют.

При работе со специальными осветителями (типа ОИ-32, ОИ-35 и др.) нужно поступать следующим образом.

  1. Микроскоп подготовить к работе обычным порядком. Зеркало взять с плоской поверхностью.
  2. Осветитель установить перед микроскопом с помощью соединительной планки, прилагаемой к осветителю, или, если ее нет, на расстоянии 20 см от зеркала.
  3. Световой поток направить на зеркало, для чего корпус осветителя необходимо наклонить.
  4. Закрыв диафрагму осветителя и перемещая патрон лампы вдоль оси, добиться четкого изображения ее нити на закрытой диафрагме конденсора.
  5. На предметный столик микроскопа установить и укрепить клеммами препарат.
  6. Открыв диафрагмы конденсора и осветителя при малом или среднем увеличении (объективы х8 или х40), найти оптическую плоскость препарата.
  7. Закрыв диафрагму осветителя и слегка передвигая зеркало, установить изображение диафрагмы осветителя в центр поля зрения микроскопа.
  8. Перемещая конденсор микроскопа по вертикали, получить наиболее четкое изображение границ диафрагмы осветителя. После этого конденсор не подлежит передвижению. Освещение препарата можно уменьшить при помощи диафрагмы конденсора.
  9. Под контролем глаза раскрыть диафрагму осветителя, пока свет не зальет почти полностью поле зрения микроскопа. Дальнейшее раскрытие диафрагмы осветителя не улучшает освещения исследуемого объекта.
  10. На препарат нанести каплю масла, на тубусе установить иммерсионный объектив, отрегулировать освещение исследуемого объекта и приступить к микроскопии.

Точное исполнение изложенных приемов настройки освещения по Келеру является необходимым условием при специальных исследованиях (микрофотографии, установке фазово-контрастного устройства и т. д.).

Иммерсионный микроскоп содержат в чистоте и предохраняют от механических повреждений. При соблюдении этих требований микроскоп может безотказно работать продолжительное время. После работы с объектива обязательно удаляют иммерсионное масло.

Дополнительные приспособления к биологическому микроскопу

Дополнительные приспособления позволяют максимально использовать все возможности биологического микроскопа, облегчают условия работы и значительно расширяют диапазон его применения. В микробиологии наиболее часто применяются следующие приспособления.

  1. темнопольные конденсоры: кардиоид-конденсор и параболоид-конденсор;
  2. фазово-контрастные приспособления: КФ-4 и другие модели;
  3. бинокулярные насадки: АУ-12 и другие модели, которые приближают микроскопию к условиям естественного зрения. Многие модели микроскопов имеют собственные бинокуляры: БИОЛАМ Р-15, БИОЛАМ Р-17, БИОЛАМ П-1;
  4. осветители: ОИ-32, ОИ-35 и другие модели. Источники искусственного света обеспечивают оптимальное и стабильное освещение, интенсивность света в них регулируют реостатом;
  5. микрометры: окуляр-микрометр и объект-микрометр, которые используют для измерения микроскопических объектов;
  6. нагревательный столик, который устанавливают вместо предметного и таким образом обеспечивают постоянную температуру 37 0 С; применяют для длительного наблюдения за живыми микроорганизмами;
  7. рисовальный столик, который используют для высококачественной зарисовки препарата; с его помощью можно одновременно видеть изображение объекта и бумаги, расположенной на столе вблизи микроскопа, и обводить на бумаге контуры объекта;
  8. оптические светофильтры: цветные и нейтральные; их устанавливают между источником света и микроскопом и применяют при микрофотографии и специальных методах микроскопии;
  9. микрофотонасадки: МФН-11, МФН-12 и другие модели, их используют для фотографирования микроскопических объектов;
  10. микрокиноустановки, предназначенные для цейтраферной (прерывистой) микросъемки в сочетании с фазово-контрастной микроскопией; они позволяют изучить динамику роста и размножения микроорганизмов, влияние на них разных факторов и многие другие вопросы.

Микроскоп с конденсором темного поля

В микробиологии нашел применение микроскоп с конденсором темного поля. Его используют для повышения контрастности изображения, что имеет большое значение для изучения подвижности бактерий, которые в живом состоянии слабоконтрастны и не видны в обычном микроскопе.


Микроскопия в темном поле основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля − свечение пылинок в воздухе темного помещения, в которое солнечный луч проникает через небольшую щель).

Для создания темного поля в биологическом микроскопе применяют: щелевой метод, затемнение в объективе, специальные конденсоры − параболоид-конденсор или кардиоид-конденсор, которыми заменяют конденсор в биологическом микроскопе.

Параболоид-конденсор имеет в центре затемнение, задерживающее центральные лучи света, и внутреннюю вогнутую зеркальную поверхность для отражения краевых лучей. В кардиоид-конденсоре лучи вначале отражаются от выпуклой зеркальной поверхности, затем от вогнутой. Краевые лучи, выходящие из темнопольного конденсора, проходят в косом направлении и не попадают в объектив, поэтому поле зрения микроскопа остается темным. В объектив попадают лучи, отраженные от объекта, в связи с чем в поле зрения можно наблюдать характерное изображение — на темном поле зрения ярко светятся микробные клетки и другие частицы, находящиеся в препарате.

В качестве источников света для микроскопа с конденсором темного поля используют сильные осветители (ОИ-32, ОИ-35). Настройку освещения и установку препарата («раздавленная капля») производят, руководствуясь изложенными выше правилами работы с биологическим микроскопом. Рекомендуется употреблять сухие объективы и предметные стекла толщиной 0,8-1,2 мм. Работа с темнопольным конденсором осуществляется в определенной последовательности.

  1. После настройки освещения и установки препарата обычный конденсор заменяют темнопольным.
  2. На верхнюю линзу опущенного конденсора наносят каплю жидкости (кедровое масло, дистиллированную воду), поднимают его вверх до тех пор, пока эта капля не коснется предметного стекла и не распространится по нему.
  3. Вращением макрометрического и микрометрического винтов производят фокусировку изучаемого препарата, при этом в поле зрения должно появиться светлое кольцо с темным пятном посредине.
  4. Поднимают конденсор до появления светлого пятна (если форма светлого пятна или кольца неправильная, значит капля иммерсионной жидкости мала).
  5. Винтами конденсора выводят пятно в центр поля зрения и приступают к исследованию.

При работе с иммерсионными объективами необходимо для уменьшения апертуры объектива внутрь него вложить специальную диафрагму, имеющуюся в наборе конденсора темного поля. При смене объективов конденсор дополнительно настраивают винтами.

Фазово-контрастный микроскоп

Метод фазового контраста позволяет наблюдать слабоконтрастные биологические объекты (микроорганизмы, растительные клетки) в неокрашенном состоянии, получая при этом контрастное их изображение. В отличие от микроскопа с конденсором темного поля, выявляющего лишь контуры объекта, метод фазового контраста позволяет увидеть элементы внутренней структуры рассматриваемого прозрачного объекта.

Известно, что качество микроскопии во многом определяется контрастностью объектов, которые в зависимости от светопоглощения подразделяются на амплитудные и фазовые.

Амплитудные объекты характеризуются различным светопоглощением, поэтому они изменяют амплитуду (интенсивность) проходящего через них света. К амплитудным объектам относятся все окрашенные препараты, которые изображаются с большим или меньшим контрастом.

Фазовые объекты имеют одинаковое светопоглощение на разных участках, но отличаются оптической плотностью. При прохождении света через такие объекты амплитуда его не меняется, а изменяется фаза колебания, что не фиксируется глазом. К фазовым объектам относятся живые неокрашенные микроорганизмы, изображение которых в обычном микроскопе отличается малой контрастностью.

Фазово-контрастный микроскоп дает возможность преобразовывать фазовые изменения световых волн, проходящих через объект, в амплитудные, в результате чего даже прозрачные микроорганизмы становятся видимыми. Прозрачные биологические объекты при фазово-контрастной микроскопии характеризуются достаточно высокой контрастностью — в зависимости от фазовой пластинки они могут давать темные изображения на более светлом поле (явление положительного фазового контраста) или же светлые изображения на темном поле (явление отрицательного фазового контраста). Тип прибора обычно указан в его паспорте.

Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное приспособление КФ-4, в комплект которого входят следующие предметы:

  • объективы с фазовым кольцами, изменяющие фазу и уменьшающие амплитуду световой волны. На их оправе обозначен дополнительный индекс «Ф» − Ф х 10, Ф х 20, Ф х 40, Ф х 90;
  • фазовый конденсор с револьвером кольцевых диафрагм для каждого объектива. Индексом «О» обозначено отверстие с ирисовой диафрагмой для наблюдения препарата обычным методом;
  • вспомогательный микроскоп малого увеличения, которым заменяют окуляр при наблюдении за настройкой освещения.

При фазово-контрастной микроскопии используют осветители типов ОИ-32 или ОИ-35.

Для исследования методом фазового контраста готовят влажные препараты типа «раздавленная капля». Для этой цели желательно отбирать тонкие стекла. Для длительного наблюдения покровное стекло по краям закрепляют вазелином.

Последовательность работы с фазово-контрастным устройством следующая.

  1. Заменяют конденсор микроскопа специальным фазово-контрастным конденсором и устанавливают его таким образом, чтобы при подъеме фронтальная линза находилась на уровне предметного столика. Револьвером включают кольцевую диафрагму «О».
  2. Обычные объективы заменяют фазовыми.
  3. Помещают препарат на предметный столик микроскопа.
  4. Макрометрическим винтом добиваются точной фокусировки на плоскость исследуемого препарата.
  5. Устанавливают освещение по правилам Келера, которые изложены выше, после чего в положении осветительной лампы, зеркала и конденсора никаких изменений не допускается.
  6. Вместо окуляра вставляют вспомогательный микроскоп. Перемещая окуляр вспомогательного микроскопа внутри тубуса, получают четкое изображение фазового кольца. В этом положении окуляр фиксируют винтом.
  7. Вращая револьвер конденсора, включают нужную кольцевую диафрагму, в результате чего в окуляре помимо фазового темно-серого кольца объектива появится изображение светлого кольца диафрагмы конденсора.
  8. Вращая центрировочные винты, совмещают светлое кольцо конденсора с темным кольцом объектива.
  9. Вспомогательный микроскоп заменяют окуляром.
  10. При исследовании объекта используют желто-зеленый светофильтр, который входит в комплект фазово-контрастного устройства.

При правильной установке освещения изображение объектов в препарате должно получиться очень контрастным. При смене объективов или препарата необходимо проверить совмещенность кольцевой диафрагмы конденсора с фазовым кольцом объектива.

Люминесцентный микроскоп

Фотолюминесценцией называют свечение объектов, возникающее в результате поглощенной ими лучистой энергии. Вследствие некоторых причин свет люминесценции обладает большей длиной волны, чем поглощенный (правило Стокса). Поэтому люминесценцию выгодно возбуждать либо ультрафиолетовыми лучами (30-400 нм), либо сине-фиолетовыми. В обоих случаях возникает люминесценция в цветовой гамме всего или большей части видимого спектра, что дает цветное изображение.

Объект, не дающий явления люминесценции, окрашивают специальными красителями — флюорохромами, после чего нефлюоресцирующие компоненты препарата начинают проявлять явления флюоресценции. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, ФИТЦ (флюоресцеина изотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов. Этот вид люминесценции носит название наведенной, вторичной, в отличие от первичной — собственной флюоресценции, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, а также некоторыми продуктами нормального и патологического обмена.

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычными методами обладает рядом преимуществ: цветным изображением, высокой степенью контрастности светящихся объектов на темном поле, возможностью исследования как прозрачных, так и непрозрачных живых объектов, различных жизненных процессов в динамике их развития, а также возможностью обнаружения и установления локализации отдельных микробов и вирусов.

В настоящее время отечественная промышленность выпускает несколько моделей люминесцентных микроскопов, обеспечивающих исследование объектов путем их освещения в проходящем или отраженном свете в стационарных и полевых условиях: ЛЮМАМ Р-8, МЛД-2, МЛП-01, и ряд моделей для специальных исследований (универсальный исследовательский биологический микроскоп МБИ-15-2). Кроме микроскопа с вмонтированным в него осветителем, работающим на ртутно-кварцевой лампе (ДРШ 250-3, ДРШ 100-2 и другие модели) в комплект прибора входят набор объективов, окуляров и светофильтров, электропульт для питания ртутно-кварцевой лампы, а также специальная переходная втулка фототубуса и втулка фотокамер для установки микрофотонасадки (МФН-11 или МФН-12). Светофильтры, имеющиеся в наборе микроскопа, предназначены для выделения из общего излучения источника света строго определенных участков спектра.

В микробиологии применяют два метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител. Метод флуорохромирования почти не отличается от общеизвестных методов окрашивания анилиновыми красителями, хотя и требует меньше времени (доли минуты). В бактериологии этот метод применяется для диагностики таких инфекционных форм, как туберкулез, дифтерия, гонорея, возвратный тиф и др. Кроме перечисленных, отечественная промышленность выпускает микроскопы других типов и приспособления к ним. Из них следует назвать ультрафиолетовый, поляризационный, интерференционный, анаптральный и стерескопический микроскопы. Последнее слово микроскопической техники − биологические микроскопы нового поколения единой системы «ЕС» с широкопольной оптикой повышенного контраста изображения со встроенным осветителем (лампа КГМ-6-20) и блоком питания. Эти микроскопы (ЕС БИМАМ Р-11, ЕС БИМАМ Р-13, ЕС БИМАМ Р-31) оснащены бинокуляром, столом с координатным перемещением и предназначены для наблюдения объектов в проходящем свете в светлом поле.

Электронный микроскоп

Электронная микроскопия делает возможным исследование объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм), и находит применение для изучения вирусов, бактериофагов, тонкого строения клеток микроорганизмов и других субмикроскопических объектов, а также макромолекулярных структур.

Приготовление препаратов для исследования микроорганизмов в электронном микроскопе имеет ряд особенностей (максимальная очистка исследуемого материала от примесей; малая толщина биологического объекта, не более 0,1 мкм; препараты готовят на специальных пленках-подложках, так как стекло непроницаемо для электронов; для предохранения объекта от разрушения потоком электронов препарат исследуют в течение минимального времени).

Различают прямые и косвенные методы приготовления препаратов. При прямых методах исследуемый материал наносят на ультратонкую пленку-подложку, предварительно помещенную на опорную металлическую сеточку, содержащую до 100 ячеек в 1 мм. Используют органические или неорганические пленки-подложки из коллодия, формвара, углерода, кварца и др. При электронной микроскопии эти пленки не должны обнаруживать собственной структуры и при этом быть достаточно прочными, чтобы выдержать облучение электронами. В биологических исследованиях применяют коллоидные пленки толщиной порядка 10-20 нм.

Широкое распространение получил метод выращивания различных микроорганизмов непосредственно на коллодиевых пленках, находящихся на поверхности питательной среды, и серийного их исследования в электронном микроскопе.

При косвенном методе на объект наносят тонкий слой какого-либо вещества (коллодий, кварц, углерод, разнообразные пластмассы) и делают отпечаток-реплику структуры его поверхности. Приготовленный таким образом препарат изучают в электронном микроскопе.

Повышение контрастности изображения объектов достигается несколькими методами.

Метод оттенения

На исследуемый объект наносят тонкий слой металла (хром, золото, уран и др.). Оттенение препаратов проводят на специальных установках вакуумного распыления. При оттенении тяжелыми металлами удается значительно повысить контрастность изображения и получить представление о третьем его измерении.

Метод позитивного контрастирования

Препарат обрабатывают химическими веществами, которые специфически соединяются с определенными структурами объекта. Так, например, уранил-ацетат обнаруживает нуклеиновые кислоты и нуклеопротеиды, осмий — липоиды; белки выявляются при обработке солями свинца, фосфорно-молиб-деновой и фосфорно-вольфрамовой кислотами. В результате обработки эти структуры становятся менее проницаемыми для электронов и на экране микроскопа выглядят темными на светлом фоне поля.

Метод негативного контрастирования

Контрастное вещество (например, фосфорно-вольфрамовая кислота при нейтральном значении рН) при обработке препарата не проникает внутрь, а покрывает его поверхность снаружи. Создается эффект негативного контраста — на темном фоне фосфорно-вольфрамовой кислоты, которая задерживает электронные лучи, выявляются светлые структуры более проницаемого для электронов биологического объекта.

Наиболее полные сведения о внутренней организации микроорганизмов можно получить, применяя метод ультратонких срезов.

Исследуемый объект фиксируют, затем обезвоживают в спиртах восходящей концентрации и заливают в полимеризующиеся пластмассы (например, метакрилаты). После полимеризации из блоков с помощью специальных ультра-микротомов готовят ультратонкие срезы толщиной 15-30 нм, контрастируют их и исследуют.

Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии

Окрашенные тела микроорганизмов резко отличаются от общего фона препарата, что позволяет установить: а) ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта; б) степень чистоты выделяемой культуры; в) некоторые морфологические особенности микроорганизмов (форму, размеры, наличие спор, жгутиков, капсул).

Приготовление окрашенного препарата состоит из нескольких последовательных операций: подготовки мазка, высушивания, фиксации, окраски. Для этого используют совершенно чистые обезжиренные стекла. Наиболее простой способ обезжиривания состоит в натирании предметного стекла кусочком сухого мыла, а затем протирании чистой марлей. Капля воды, нанесенная на хорошо подготовленную поверхность, легко расплывается.

При взятии бактериальной культуры поступают следующим образом:

  1. нагревают до покраснения бактериологическую петлю в пламени; петлю держат в правой руке за петледержатель;
  2. берут пробирку с культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность питательной среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцем правой руки к ладони;
  3. обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут материал;
  4. вынимают петлю, обжигают край пробирки, закрывают ее пробкой (рис. 4).

Рисунок 4. Техника приготовления мазка

Если препарат готовят из бактериальной культуры, выращенной на плотной питательной среде, то на предметное стекло предварительно наносят каплю стерильного физиологического раствора или стерильной водопроводной воды.

Взятый материал осторожно круговыми движениями распределяют по стеклу ровным тонким слоем, после чего петлю немедленно стерилизуют в пламени. Следует помнить, что в этот период происходит работа с живыми микроорганизмами, поэтому резкие движения могут привести к разбрызгиванию материала и повлечь за собой инфицирование рук и окружающих предметов.

Мазки высушивают на воздухе при комнатной температуре или в токе теплого воздуха, держа предметное стекло высоко над пламенем. Нельзя допускать перегрева, так как при этом может нарушиться структура микроорганизмов.

При фиксации мазка микроорганизмы погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла, не смываясь при дальнейшей обработке. Наиболее распространенным способом является фиксация в пламени. Предметное стекло (мазком вверх) троекратно проводят через пламя. При таком способе фиксации сохраняются форма бактерий, споры, зерна волютина, однако способ нельзя применять для мазков крови, мазков-отпечатков из органов, а также при выявлении спор и жгутиков. Для этих целей проводят фиксацию в этиловом спирте (20 мин.), в жидкости Никифорова, состоящей из смеси равных объемов этилового спирта и серного эфира (20 мин.), в холодном ацетоне.

Существуют простые и сложные методы окраски. При применении простых методов используется только одна краска — водный фуксин (1-2 мин.) или метиленовый синий (3-5 мин.). По окончании окрашивания препарат промывают струей воды до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, и сушат его на воздухе при комнатной температуре или осторожно промокая фильтровальной бумагой.

Сложные методы окраски предусматривают последовательное использование нескольких красителей различного химического состава, что позволяет выявить определенные структуры бактериальной клетки.

Окраска по Граму

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

  1. Окрасить мазок генцианвиолетом (2 мин., через фильтровальную бумагу).
  2. Бумагу удалить, оставшуюся краску слить.
  3. Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин.).
  4. Раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% этанола (30-40 с., осторожно покачивать стекло).
  5. Тщательно смыть спирт водой.
  6. Окрасить водным фуксином (2 мин.).
  7. Промыть водой и высушить.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамполо-жительные — темно-фиолетового цвета и грамотрицательные — красного (рис.5). Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют аро-матические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. В результате образуется прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта.

Успех окраски зависит от ряда причин и прежде всего от правильности обра-ботки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окрас-ки фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.

Рисунок 5. Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Реактивы для окраски по Граму

  1. Карболовый генцианвиолет
    • генцианвиолета 1 г
    • кислоты карболовой (фенола) 2 г
    • этанола 96% 10 мл
    • воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке генцианвиолет с карболовой кислотой, добавляя в начале спирт, а потом воду. Раствор выдержать сутки, профильтровать и использовать для окраски.

  1. Раствор Люголя
    • калия йодида 2 г
    • йода кристаллического 1 г
    • воды дистиллированной 300 мл

В небольшом объеме дистиллированной воды растворить йодистый калий, а затем кристаллический йод, после этого довести объем до 300 мл.

  1. Спирт 96%
  2. Водный фуксин Пфейффера

Приготовление красок

Фуксин готовят в виде концентрированного раствора Циля. Раствор обладает большой стойкостью при хранении. Его применяют при сложных методах окраски (окраска спор, кислотоустойчивых бактерий). Для простого окра-шивания используют фуксин Пфейффера (фуксин Циля, разведенный в 10 раз дистиллированной водой). Он нестоек, и готовят его для работы на один день.

Окраска кислотоустойчивых бактерий

Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам и щелочам. Это связано с наличием в кле-точной стенке и цитоплазме сравнительно большого количества липидов (воскоподобных веществ). Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными красками, поэтому применяют концентрированные растворы красок с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой тела микробных клеток, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии от бактерий, не обладающих этим свойством. Их окрашивают по методу Циля − Нильсена, разработанному с уче-том всех указанных особенностей.

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

  1. Нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 мин.).
  2. Бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% серной кислотой.
  3. Тщательно промыть водой.
  4. Окрасить леффлеровской синькой (3-5 мин.).
  5. Промыть водой и высушить.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а остальные − синими.

  1. Карболовый фуксин Циля
    • Фуксина основного 1 г
    • Спирта 96% 10 мл
    • Кислоты карболовой кристаллической 5 г
    • Воды дистиллированной 100 мл


Растереть в ступке фуксин с карболовой кислотой, спирт добавлять постепенно, а затем небольшими порциями влить дистиллированную воду.

  1. Метиленовая синь по Леффлеру
    • Насыщенного спиртового раствора метиленового синего 30 мл
    • Воды дистиллированной 100 мл
    • % водного раствора КОН 1 мл

Окраска спор

Некоторые виды бактерий образуют внутриклеточные (эндогенные) споры. В отличие от вегетативной клетки они обладают меньшим количеством свобод-ной воды, а также высоким содержанием липидов и кальция.

Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за малой проницаемости оболочки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспри-нимается только вегетативной частью микробной клетки, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее оболочки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при использовании концентрированного раст-вора краски с подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработ-ке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немед-ленно отдают краску.

Окраска спор по методу Ожешко

  1. Нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 мин).
  2. Слить кислоту, промыть водой, высушить.
  3. Зафиксировать в пламени.
  4. Окрасить по методу Циля − Нильсена. При этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы − в синий (рис. 6). Часто для окраски спор используют только метод Циля − Нильсена.

Рисунок 6. Споры возбудителя столбняка, окрашенные в красный цвет

Окраска включений волютина

Волютин — производное нуклеиновой кислоты — играет роль запасного питательного вещества. Среди включений запасного характера − жиры, гликоген, волютин, который занимает особое место. На основании его присутствия и особого расположения в клетке ставят предварительный диагноз методом бактериоскопии при подозрении на дифтерию. Наиболее демонстративные результаты удается получить при окраске зерен волютина по методу Нейссера.

Методика проведения

  1. Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 мин).
  2. Промыть.
  3. Окрасить раствором Люголя (30 с).
  4. Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 мин).
  5. Промыть препарат и высушить.

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, воспринимает щелочной краситель везувин и приобретает желтый цвет. Зерна волютина, прочно фиксировавшие ацетат цинка, − темно-синие, почти черные.

Реактивы для окраски по методу Нейссера

  1. Уксуснокислая синька Нейссера
    • метиленового синего 0,1 г
    • спирта 96% 2 мл
    • уксусной кислоты конц. 5 мл
    • воды дистиллированной 100 мл
  2. Везувин
    • везувина 2 г
    • воды дистиллированной 300 мл

Прокипятить приготовленный раствор и, охладив, профильтровать.

Обнаружение капсул у бактерий

Некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, его называют капсулой. В состав капсул входят, главным образом, полисахариды, но у некоторых они содержат и полипептиды. Капсулы имеют консистенцию геля, поэтому при микроскопии живых бактерий они видны очень плохо. Для их обнаружения применяют негативную окраску. Все перечисленные методы относятся к позитивным, так как при их использовании окрашиваются микроб-ные клетки. При негативных способах краситель заполняет пространство вокруг бактерий, в результате чего они выглядят светлыми частицами на темном фоне.

Методика обнаружения капсул по методу Бурри

  1. Смешать на предметном стекле немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши; приготовить тонкий мазок.
  2. Высушить на воздухе и бактериоскопировать. На темном фоне хорошо видны бесцветные капсулы.

Модификация по Бурри − Гинсу включает создание фона индикатором конго красный, последующую фиксацию в 5% растворе НСl и дополнительную окраску водным фуксином. В результате общий фон − темного цвета, капсулы − бесцветные, а тела бактерий − красные.

Окраска по Романовскому — Гимзе

Относится к сложным методам и применяется чаще всего для мазков-отпечатков из органов или мазков крови после фиксации в жидком фиксаторе. Позволяет выявить ядерные элементы бактериальных клеток и гранулы волютина. Для окраски берут каплю готовой краски на 1 мл воды, которая должна быть подщелочена до рН 7,2.

Методика проведения

  1. Поместить препарат (мазком вниз) в чашку Петри, подложив под края стекла спички или кусочки предметных стекол.
  2. Подлить краску сбоку так, чтобы она без пузырей подтекла под мазок (красить 1-24 ч.).
  3. Промыть водой (рН 7,2) и высушить.

Протоплазма молодых клеток окрашивается в сине-фиолетовый цвет, ядерные элементы — в красно-фиолетовый.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Какие типы микробиологических лабораторий существуют.
  2. Принципы организации микробиологической учебной лаборатории. Оснащение микробиологической лаборатории и рабочего места. Правила работы и техника безопасности.
  3. Устройство светового микроскопа. Иммерсионная микроскопия.
  4. Темнопольная, фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопия и микроскопы (устройства).
  5. Приготовление фиксированных препаратов мазков.
  6. Простые и сложные методы окраски. Механизм и этапы окраски по Граму. Особенности окраски методами Романовского, Ожешко, Бурри − Гинса, Нейссера, Циля − Нильсена.
  7. Приготовление препаратов для изучения микроорганизмов в нативном состоянии. Методы «висячей», «раздавленной» капли. Витальная (прижизненная) окраска.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

  1. Ознакомление с основными приборами и оборудованием, используемыми в микробиологических лабораториях.
  2. Изучение иммерсионной системы светового микроскопа.
  3. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска простыми методами.
  4. Микроскопия окрашенных препаратов с использованием обычных и иммерсионных систем.
  5. Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска сложными методами (по Граму, Цилю — Нильсену, Ожешко, Нейссеру, Бурри — Гинсу).
  6. Приготовление препаратов для изучения бактерий в живом состоянии.
  7. Приготовление мазков «висячей» и «раздавленной» капли.
  8. Приготовление препаратов, окрашенных метиленовым синим.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Записать основные правила работы в микробиологической лаборатории.
  2. Приготовить нативные мазки «висячей» и «раздавленной » капли.
  3. Приготовить фиксированные препараты из смеси бактериальных культур.
  4. Провести микроскопию и зарисовать микроскопические препараты.

ТЕМА № 2. Морфология бактерий. Ультраструктура бактериальной клетки

Знание морфологии и изучение ультраструктуры бактерий является основой микроскопического метода исследования и необходимо для правильного применения химиотерапевтических препаратов.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ


Изучение морфологии и ультраструктуры бактерий.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ

  1. Формы бактериальных клеток и методы изучения морфологических особенностей.
  2. Основные морфологические особенности бактерий.
  3. Основные морфологические типы бактерий.
  4. Элементы ультраструктуры бактериальной клетки.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ

  1. Дифференцировать бактерии по морфологическим признакам.
  2. Определить родовую принадлежность конкретных бактерий по морфологическим признакам.

Морфология бактерий

По форме клеток бактерии делятся на шаровидные, палочковидные и извитые. Шаровидные бактерии (кокки) имеют сферическую форму и по взаимному расположению клеток после деления различаются:

  • микрококки- клетки расходятся и располагаются одиночно;
  • диплококки- клетки располагаются попарно;
  • стрептококки-кокки делятся в одной плоскости и не расходятся после деления;
  • тетракокки-деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и клетки располагаются по четыре;
  • сарцины (пакеты)- деление происходит в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях;
  • скопления кокков, внешне напоминающие виноградную гроздь, называются стафилококками.

Кокки имеют диаметр 1-2 мкм.

Палочковидные бактерии различаются формой клеток, размерами и расположением. Длина их в зависимости от вида микроорганизма колеблется от 0,5 до 8 мкм, а поперечник — от 0,3 до 2 мкм.

Палочки могут быть правильной и неправильной формы, в том числе ветвящиеся, например, у актиномицетов.
По характеру расположения клеток в мазках выделяют:

  • монобактерии — расположены отдельными клетками;
  • диплобактерии — расположены по две клетки;
  • стрептобактериии — после деления образуют цепочки клеток.

Палочковидные бактерии могут образовывать споры: бациллы и клостридии.

Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками и могут иметь один или несколько витков спирали. Слегка изогнутые палочки называются вибрионами. Они имеют длину 1-3 мкм.

Спириллы— длинные, изогнутые (один или несколько завитков).

Спирохеты длинные, тонкие клетки с большим количеством мелких завитков.

Структура бактериальной клетки

Клетка — универсальная структурная единица живой материи. Организация бактериальной клетки обеспечивает удвоение биомассы за определенный срок за счет размножения посредством бинарного деления.

Элементы ультраструктуры бактериальной клетки

В составе прокариотической клетки выделяют следующие структуры.

  1. Клеточная стенка; по химической структуре клеточной стенки различают грамположительные и грамотрицательные бактерии.
  2. Периплазматическое пространство.
  3. Цитоплазматическая мембрана.
  4. Цитоплазма, нуклеоид, мезосомы (аналог митохондрий у эукариотов), рибосомы, включения;
  5. У некоторых бактерий — капсула, микрокапсула, жгутики, плазмиды, фимбрии (реснички), споры.

Клеточная стенка — важный и обязательный структурный элемент подавляющего большинства прокариотных клеток. На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50% сухих веществ клетки. Клеточная стенка служит механическим барьером между протопластом и внешней средой и придает клеткам определенную, присущую им форму.

Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную струк-туру, ковалентно связана с ригидным слоем, содержит небольшие количества липидов, полисахаридов и белков. Она значительно толще, чем у грамотри-цательных бактерий, и достигает 20-60 нм. Основную массу стенки составляют 5-6 слов пептидогликана, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Особенностью пептидогликанов грамположительных бактерий является от-сутствие диаминопимелиновой кислоты.

Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-18 нм. Ригидный слой представлен 1-2 слоями пептидогликана, в котором есть диаминопимелиновая кислота. В составе клеточной стенки содержится много лиопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, больше белка, но отсутст-вуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки представлен сложной мозаикой из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембра-ны.

Некоторые бактерии имеют пространство (зону) между клеточной стенкой и плазматической мембраной — периплазматическое пространство (периплазма). Толщина периплазмы составляет около 10 нм и может включать до 20% всей находящейся в клетке воды. В ней локализуются некоторые ферменты и транспортные белки — переносчики соответствующих субстратов.

К клеточной оболочке бактериальной клетки тесно прилегает внешний слой цитоплазмы — цитоплазматическая мембрана. Она состоит из двух слоев липидов и встроенных в липидную мембрану белковых молекул. Компоненты цитоплазматической мембраны ( ЦПМ ) составляют около 10% сухого веса бактериальной клетки. Эта полупроницаемая мембрана контролирует транспорт питательных веществ и воды в клетку, а также является физическим барьером между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой.

Содержимое тела бактериальной клетки, или ее цитоплазма, представляет собой желеобразный, вязкий раствор, в котором растворены различные органические и неорганические соединения. Бактериальная цитоплазма неподвижна, имеет высокую плотность, содержит мелкие зерна, состоящие из 60% РНК и 40% протеина, представляющие собой рибонуклеопротеиды, получившие название «рибосом». Они выполняют функцию синтеза белка. Цитоплазма большинства бактерий содержит ДНК и запасные гранулы (крахмала, гликогена, жировых веществ), пигментные скопления, сера, кальций.

Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат, состоит из двойной нити ДНК, сомкнутой в кольцо и свободно погруженное в цитоплазму, в отличие от эукариот. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки.

Мембранные структуры прокариот менее дифференцированы, чем органоиды эукариот. Бактерии имеют лишь аналоги некоторые из них. Например, аналогом митохондрий у прокариот являются мезосомы, которые образуются путём инвагинации цитоплазматической мембраны и содержат ферменты, необходимые для синтеза АТФ.

У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой, которые относятся к факторам патогенности. Микрокапсулы выявляются на электрон-ных микрофотографиях в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула (слизистый слой) играет роль внешнего покрова бактерии, защищает от неблагоприятного воздействия факторов внешней среды и обнаруживается под световым микроскопом после окрашивания по методу Бурри − Гинса.

У некоторых видов микробов имеются пили (реснички, фимбрии, филаменты), представляющие собой образования, которые значительно короче и тоньше жгутиков. Они покрывают тело клетки. Полагают, что они не являются органами передвижения, а способствуют прикреплению микробных клеток к поверхности некоторых субстратов.

Жгутики предназначены для передвижения бактерий. Жгутики построены из специального белка –флагелина. Длина его составляет 20 мкм, диаметр 10-20 нм.

По расположению жгутиков подвижные микробы подразделяются на 4 группы (рис. 7):

  • монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце (холерный вибрион);
  • амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
  • лофотрихи — бактерии, которые имеют по пучку жгутиков на одном конце (палочки сине-зеленого молока);
  • перитрихи — бактерии, обладающие жгутиками по всей поверхности тела (кишечная палочка).

Рисунок 7. Жгутикование бактерий: A — монотрихиальное, B — лофотрихиальное, C — амфитрихиальное,
D — перитрихиальное.

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их фор-мы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.

Прижизненная (витальная) окраска

Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового си-него или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют.

Приготовление препарата «раздавленная капля»

На центр обезжиренного предметного стекла наносят каплю жидкой бульонной культуры. Если культура выращивалась на плотной питательной среде, то на стекло наносят каплю стерильного изотонического раствора натрия хлорида, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии размешивают в приготовленной капле. Можно заранее приготовить взвесь микроорганизмов в изотоническом растворе и взять каплю из нее. На исследуемый материал накладывают покровное стекло так, чтобы не было пузырьков воздуха. Каплю надо брать такой величины, чтобы она заполняла все простран-ство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края по-кровного. Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Микроскопируют, используя объективы 40х или 90х. Очень хорошие результаты получают, применяя темнопольное или фазово-контрастное устройства. Препараты быстро высыхают, поэтому, если их приходится рассматривать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2-3 влажных кружка фильтро-вальной бумаги, покрытых двумя сухими.

Во избежание высыхания препарата и вызываемого конвекцией турбулент-ного движения жидкости подобные препараты можно герметизировать. Для этой цели следует пользоваться парафиновым маслом, смесью равных частей парафина и вазелина или лаком для ногтей.

В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что облигатные анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям.

Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в та-ких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.

Приготовление препарата «висячая капля»

Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной взвеси. Затем предметное стекло с лункой, края которой пред-варительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки, в результате чего стекла склеиваются. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно приготовленном препарате капля свободно висит над лункой, не касаясь ее дна или края (рис.8). Микроскопируют со стороны покровного стекла, причём вначале следует найти край на малом увеличении и при суженной диафраг-ме, используя сухой объектив 8х, затем на большом и продолжить наблюдение.

Рисунок 16. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем

Агаризованную среду можно подсушить, поместив чашки в термостат на 2—3 суток крышками вниз. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2—4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпатель. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.

При глубинном посеве точно измеренный объем (как правило, 0,1, 0,5 или 1 мл) суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 48—50° агаризованную среду, тщательно перемешивают и затем немедленно выливают в чашку Петри. Среде дают застыть. В случае глубинного посева обычно пользуются средой, разлитой в пробирки. При больших масштабах работы среду по пробиркам не разливают, а поступают следующим образом: по

1 мл из соответствующего разведения переносят стерильной пипеткой в 2—4 стерильные чашки Петри. Затем заливают чашки 15—20 мл расплавленной и остуженной до 48—50° плотной средой и тщательно смешивают питательную среду с посевным материалом легким вращательным движением чашки по поверхности стола, после чего чашки оставляют на горизонтальной поверхности до застывания. Когда среда застынет чашки Петри помещают в термостат.

Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри с плотной средой после посева помещают в анаэростаты.

Подсчет выросших колоний

Колонии бактерий подсчитывают обычно через 3, колонии грибов и дрожжей — через 5—7, а колонии актиномицетов — через 7—15 суток инкубации в термостате.

Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и результаты суммируют. Существуют специальные счётчики для подсчёта колоний (рис.17). Для подсчёта колоний чашкуПетри крышкой вниз помещают на стерильный столик (1), подсвечиваемый снизу, и подсчитывают колонии пером с пружинным острием (2). Остриём пера касаются дна чашки в участке, соответствующем положению колоний, и нажимают на перо. В результате на стекле остается метка, а держатель поднимается вверх, замыкая цепь, и показания счётчика увеличиваются на единицу. Затем острие пера поднимают над стеклом, пружина возвращает его в исходное положение, и цепь размыкается.

Рисунок 17. Счетчик для подсчета числа колоний микроорганизмов

Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от 30—50 до 100— 150 колоний. Если число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из данного разведения на одной чашке.

Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:

  • М — количество клеток в 1 мл,
  • а — среднее число колоний при высеве данного разведения,
  • 10 — коэффициент разведения,
  • n — порядковый номер разведения, из которого сделан высев,
  • V — объем суспензии, взятый для посева, в мл.

Метод посева в агаризованную среду осуществляют путем внесения в стерильную чашку Петри суспензии микроорганизмов из соответствующего разведения с последующим заливанием расплавленной и охлажденной до 45 0 агаризованной средой. Содержимое чашки перемешивают и дают среде застыть.

Метод посева в тонком слое предполагает внесение разведенной суспензии микроорганизмов в пробирки с небольшим объемом (2,5 –3,5 мл) расплавленной полужидкой агаризованной средой, которую затем разливают по стерильным чашкам, уже содержащим один слой застывшей агаризованной среды и дают застыть верхнему слою.

Каждый из вышеперечисленных методов посева имеет свою область использования и определенные ограничения. При посеве на поверхность агаризованной среды все выросшие колонии являются поверхностными. Именно в этом случае изучают характерные изменения в индикаторных агаровых средах. При посеве в агаризованные среды колонии, как правило, компактны и невелики по размерам, так как формируются под слоем агара, что дает возможность учета большего их количества. Вторым преимуществом метода является возможность дополнительных манипуляций с составом среды: верхний и нижний слой могут содержать разные питательные добавки. Кроме того, к верхнему слою могут быть добавлены красители для облегчения обнаружения колоний.

Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений)

Метод нашел широкое применение для подсчета микроорганизмов, которые плохо или совсем не развиваются на плотных питательных средах. Этим же методом пользуются при определении численности бактерий, относящихся к той или иной физиологической группе. Сущность метода предельных разве-дений состоит в следующем. В пробирки с жидкой средой вносят строго из-меренный объём из различных разведений исследуемого субстрата (рис.18). После инкубации, исходя из числа пробирок, в которых наблюдался или от-сутствовал рост, рассчитывают по таблицам наиболее вероятное число клеток, содержащихся в 1 мл исходного субстрата. Необходимо отметить, что опреде-ление численности клеток чашечным методом обеспечивает большую точность по сравнению с методом предельных разведений.

Определение количества микроорганизмов методом предельных разведений включает приготовление разведений, посев в жидкую среду, регистрацию на-личия или отсутствия роста после инкубации и расчет наиболее вероятного числа клеток в единице объема исходного субстрата.

Приготовление разведений

Разведения исходной суспензии готовят точно так же, как и для чашечного метода.

Посев в среду и регистрация результатов

Питательную среду, благоприятную для развития микроорганизмов, численность которых хотят определить, предварительно разливают в пробирки (колбы) и стерилизуют. В пробирки (колбы) следует наливать одинаковый объем среды. Посев проводят из каждого разведения или из четырех-пяти последних, причем каждое разведение высе-вают в 3—5 параллельных пробирок. Количество посевного материала везде одинаково и, как правило, составляет 1 мл. Засеянные пробирки помещают в термостат. Время инкубации колеблется от 3 до 10 суток и зависит от скорости роста микроорганизмов, численность которых определяют. После инкубации регистрируют рост микроорганизмов, используя различные показатели: помут-нение среды, образование пленки, осадка, газа или накопление в среде опреде-ленных продуктов метаболизма.

Наиболее вероятное количество клеток в единице объема рассчитывают по таблице Мак-Креди (табл. 4), разработанной на основании методов вариаци-онной статистики. Для этого первоначально составляют числовую характерис-тику, которая включает три цифры. Первая цифра слева показывает число про-бирок в том последнем разведении, при высеве из которого во всех засеянных пробирках был отмечен рост. Две следующие цифры обозначают число проби-рок, в которых отмечен рост микроорганизмов при засеве их из двух последу-ющих разведений. Затем по таблице находят наиболее вероятное число микро-организмов, соответствующее данному значению числовой характеристики. Количество микроорганизмов в 1 мл (1 г) исходного субстрата соответствует этому числу, умноженному на то разведение, которое было взято для получения первой цифры числовой характеристики.


Разведение исходной суспензии 10-1 10-2 10-3 10-4
Число засеянных пробирок 4 4 4 4 4
Число пробирок, в которых обнаружен рост 4 4 3 1
Числовая характеристика 431
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов 16,5
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии 165
Разведение исходной суспензии 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Число засеянных пробирок 3 3 3 3 3
Число пробирок, в которых обнаружен рост 3 3 2
Числовая характеристика 320
Наиболее вероятное число клеток микроорганизмов 9,5
Количество клеток микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии 9,5 103

Таблица 4. Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объёма исходной суспензии (по Мак-Креди)

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

Наиболее вероятное число микроорганизмов при засеве параллельных пробирок в числе

Методы исследования в микробиологии

Методы исследования в микробиологии — Лекция, раздел Медицина, Предмет и задачи медицинской микробиологии и ее значение в деятельности врача Различают Следующие Основные Методы: Микроскопический, Микробиологический, Эк.

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспериментальный, иммунологический.

1. Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический — (бактериологический, культурный) — посев материала на питательные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одного вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из конкретного источника в определенное время, (например, штамм Shigella flexneri №8, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в генетических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы —

антитела (AT), способные вступать с данным антигеном в специфическое

взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан на выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ(диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей инфекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентификация по антигенной структуре).

Эта тема принадлежит разделу:

Предмет и задачи медицинской микробиологии и ее значение в деятельности врача

Лекция.. предмет и задачи медицинской микробиологии и ее значение в деятельности.. классификация микроорганизмов..

Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Методы исследования в микробиологии

Что будем делать с полученным материалом:

Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:

Все темы данного раздела:

Методы исследования в микробиологии
Объектомизучения микробиологии являются микроорганизмы (микробы) — мельчайшие невидимые одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или рас

Световой микроскоп с иммерсионной системой
Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз. Поэтому используется микроскопы с иммерсионной системой («иммерсио» – погружение) В состав иммерсионной систем

Фазово-контрастный микроскоп
Эта разновидность светового микроскопа позволяет изучать структуру живых неокрашенных микробов (прозрачных объектов). При прохождении света через неокрашенные микробные клетки, в отличии от окрашен

Люминесцентный микроскоп
Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра

Приготовление препарата для микроскопического исследования
Окраска по Граму. I этап — приготовление мазка. Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметр

Структура бактериальной клетки. Обязательные (постоянные) структурные элементы
Обязательными структурными элементами бактерий являются: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка. Цитоплазма прокариотов в отличие

Необязательные (непостоянные) структурные элементы
К ним относят: капсулу, спору, включения, жгутики, пили. Капсула представляет собой поверхностно расположенное слизистое образование, которое по химической природе чаще является пол

Химический состав бактериальной клетки
(свободная и связанная), нуклеиновые кислоты ДНК и РНК), белки, углеводы, липиды и минеральные соли. Свободная вода, являясь универсальной дисперсионной средой, участвует в метаболизме, связанная в

Антибиотики. Микробиологические основы химиотерапии
Химиотерапией называют лечение инфекционных, паразитарных заболеваний или опухолей химиотерапевтическими средствами /химиопрепаратами/. Химиотерапевтические препараты /ХТП/ — это химические веществ

Генетика бактерий
Микроорганизмы послужили удобной моделью для генетических исследований, приведших к важнейшим открытиям 20 века в биологии: показано, что материальным носителем (основой) наследстве

Организация генетического материала бактерий
Геном бактерий (совокупность всех генов) представлен хромосомой, плазмидами и транспозируемыми элементами (транспозонами), причем обязательным генетическим элементом является только хромосома. Хром

Изменчивость микроорганизмов
Различают генотипическую (наследуемую) изменчивость и фенотипическую (ненаследуемую, модификационную). Наследуемая изменчивость осуществляется в виде мутаций и рекомбинаций. Мутаци

Роль микроба в инфекционном процессе
Возбудитель инфекции должен быть патогенным или потенциально патогенный микробом. Патогенность /болезнетворность/ — генетически детерминированная потенциальная способность микробов данного вида при

Виды и Формы иммунитета
Различают, иммунитет тканевой /обусловливает несовместимость тканей/ и антиинфекционный / противомикробный и противопаразитарный /. Антиинфекционный иммунитет включает: естественную резист

Механизмы естественной резистентности
Главным фактором видовой невосприимчивости и невосприимчивости при генетических отклонениях является клеточная ареактивность. Клеточная, ареаятивноеть обусловлена отсутствием в организме клеток или

Общефизиологические факторы
1. Общая реактивность организма /интегральный показатель, на который оказывают влияние, например, интенсивность обмена веществ, гормональный фон процессы торможения и возбуждения участков

Антигены антитела
Специфические механизмы защиты /приобретенный иммунитет, иммунный ответ/ предполагают распознавание клетками иммунной системы генетически чужеродных субстанций /антигенов/ и специфическое реагирова

Реакции иммунитета
Реакциями иммунитета /серологическими реакциями/ называют действие между антигенами и антителами, ведущее к образованию иммунного комплекса /антиген-антитело/. Они протекают, как правило, в 2 фазы

Аллергия
Состояние повышенной чувствительности организма к различным веществам, возникающие в результате предшествующего контакта с ними называется аллергией (синонимы: сенсибилизация, гиперчувствительность

Анафилактический шок
Развивается при повторном введении сыворотки и других препаратов. Первое введение аллергена называют сенсибилизирующим. Через 1-3 недели после него в организме накапливаются анафилактические антите

Сывороточная болезнь
Развивается при первичном и при вторичном введении чужеродных сывороток. При первичном введении развивается через 10-14 дней. Чужеродная сыворотка сохраняется в организме до 3 недель. За это время

Атопии
Это повышенная чувствительность к веществам пищевого, растительного и лекарственного происхождения, у лиц с наследственной предрасположенностью. Вещества, вызывающие атонии, обычно являются простым

Инфекционная аллергия
При многих инфекционных заболеваниях развивается повышенная чувствительность к повторному внедрению в организм микробов того же вида. После первого попадания микробов в организме появляются и накап

Антибиотики
Антибиотики — это специфические продукты жизнедеятельности, обладающие высокой физиологической актив­ностью по отношению к определенным группам микроорганизмов и к злокачественным опухолям, избират

Гормоны
Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы в направлении синтеза пеп-тидных гормонов. Рань

Интерфероны, интерлейкины, факторы крови
Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфици-рование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия интерферонов до конца не выяснен. П

Моноклокальные антитела и ДНК-или РНК-пробы
Моноклональные антитела — продукты В-гибридомных клеток — используют для диагностики различных заболеваний. Об­ладая высокой специфичностью действия, они обеспечивают иден­тификацию не только вида

Рекомбинантные вакцины и вакцины-антигены
Вакцина­ция — один из основных способов борьбы с инфекционными забо­леваниями. Путем поголовной вакцинации ликвидирована нату­ральная оспа, резко ограничено распространение бешенства, по­лиомиелита

Ферменты медицинского назначения
Многообразно примене­ние ферментных препаратов в медицине. Их используют для растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний (вместо отсутствующих эндогенных ферментов), удаления не-

Энтеровирусы
Длительное сосуществование популяций человека и микроорга­низмов в процессе эволюции привело к формированию больного коли­чества видов микробов, способных вступать в паразитическое

Вирусы гриппа
Возбудитель гриппа относится к РНК-содержащим вирусам, се­мейству ортомиксовирусов. Имеет средние размеры, шаровидную (иногда нитевидную) форму. Нуклеиновая кислота его однонитчатая, состоит из 3 ф

Вирус гепатита А
Возбудитель гепатита А относится к семейству Пикорнавирусов, роду Энтеровирусов. Это РНК-содержащий мелкий вирус с кубическим типом симметрии, без суперкапсида. Hе обладает гемагглютинирующими свой

Возбудители вич и герпесвирусы
Заболевание известно с 1981 г, когда в США у двух мужчин воз­никла пневмоцистная пневмония, характерная для больных с иммунодефицитами. При обследовании у них установлено практически пол­ное отсутс

Стафилококки
Стафилококки (Staphylococcus aureus, S. epidermidis) — по­тенциально-патогенные микробы, способные вызвать различные вос­палительные, гнойно-септические, а также кишечные и респиратор­ные заболеван

Стрептококки
Возбудителями стрептококковой инфекции являются Streptococcus pyogenes — потенциально-патогенный микроорганизм, с которым связано возникновение гнойно-септических и ненагноительных заболеваний. Это

Синегнойная палочка
Синегнойную инфекцию вызывает потенциально-патогенный микроб из рода псевдомонад — синегнойная палочка (Pseudomonas, aeruginosa) — Гр- аспорогенная подвижная палочка длиной 1,5 — 3,0 мкм.

Возбудитель туберкулёза
Возбудители туберкулёза — микобактерии (Mycobacterium tuberculosis, Mucobacteriuin bovis) — Гр+ тонкие изогнутые палоч­ки без спор, капсул и жгутиков, из-за особенностей химического состава (повыше

Возбудитель дифтерии
Коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae) — Гр+ тонкие слегка изогнутые палочки, в препаратах располагающиеся под углом друг к другу. Спор и капсул нет. (в организме образуют микрокапсу

Возбудитель коклюша
Коклюш вызывает бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis) — Гр- полиморфная палочка без спор и жгутиков. В организме обра­зует капсулу. На простых средах не растет; её выращивают на картофельно-г

Возбудители криптоспоридиоза, кампилобактериоза
Кишечные инфекции, наряду с острыми респираторными заболеваниями, одна из главных причин инфекционной заболеваемости в мире. Кишечные инфекции – причина 1/3 всех случаев смерти дете

B) DNA-containing
— family Adenoviridae genus Coronavirus 3. Protozoa: species: Entamoeba histolytica Giardia intestinalis

Возбудители дизентерии
Дизентерию вызывают шигеллы, энтеробактерии рода Shigella (S.dysenteriae, S. flexneri, S.sonnei, S.boydii) — Гр- неподвиж­ные палочки длиной 2-3 мкм. Спор и капсул не образуют. Имеют фимбрии (адгез

Возбудители эшерихиозов
Эшерихии — типичные представители семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae). Род Escherichia представлен 1 видом (E.coli). Эшерихиозы вызывают патогенные варианты E.coii — Гр-палочки длиной 2-6

Роль других эшерихий
Условно-патогенные E.coli способны вызвать эндогенные и эк­зогенные гнойно-воспалительные процессы различной локализации, сепсис; они, как правило, возникают в результате ослабления им­мунной систе

Возбудитель ботулизма
Ботулизм вызывают клостридии (Clostridium botulinum) — круп­ные спорообразующие Гр+ палочки. Овальная спора придаёт клетке сходство с теннисной ракеткой. Подвижен (перитрих), капсулу не образует. О

Возбудители сальмонеллезов
Сальмонеллёзы вызывают многочисленные представители рода Salmonella — S. typhimurium, S.enteritidis, S.choleraesuis, S.haifa, S.anatum, реже — другие. Они отличаются от возбудителей тифо-паратифозн

Возбудитель сифилиса
Сифилис вызывает Treponema pallidum — бледная трепонема. Эта спирохета имеет 8-12 равномерных завитков и окрашивается по Ро­мановскому-Гимза в бледно-розовый цвет. В окрашенных препаратах она неотл

Возбудитель гонореи
Нейссерии гонореи, гонококки (Neisseria gonorrhoeae) — Гр-кокки, имеющие вид кофейного зерна, располагаются попарно (дип­лококки). Спор и жгутиков нет. Имеют пили, обеспечивающие адгезию. В организ

Проблемы внутрибольничных инфекций
В настоящее время для медицины серьезной проблемой остаются внутрибольничные инфекции (ВБИ). Для обозначения инфекционных болезней (ИБ), возникающих в условиях стационара, используются различные те

Принципы клинической микробиологии
Получив знания относительно методов микробиологической диагностики, лечения и профилактики основных инфекций человека, а также об их возбудителях, будущему врачу необходимо, используя эти знания, о

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ

Прочитайте:

  1. I. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  2. II МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  3. II. Методы, подход и процедуры диагностики и лечения
  4. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  5. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  6. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  7. II. МЕТОДЫ, ПОДХОДЫ И ПРОЦЕДУРЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ
  8. Iv. Методы коррекции эмоционального стресса
  9. VI. ЛАБОРАТОРНЫЕ И ИНСРУМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
  10. X. Освенцим: научные исследования

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспери­ментальный, иммунологический.

1.Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2.Микробиологический — (бактериологический, культурный) — посев материала на питатель­ные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одною вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из кон­кретного источника в определенное время, (например, штамм Shigella flexneri №8, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в гене­тических экспериментах).

3.Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы — антитела (AT), способные вступать с данным ан­тигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан па выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей ин­фекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентифи­кация по антигенной структуре).

Дата добавления: 2015-09-27 | Просмотры: 338 | Нарушение авторских прав

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МИКРОБИОЛОГИИ 204

Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический, экспери­ментальный, иммунологический.

1.Микроскопический — изучение микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурные элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический — (бактериологический, культурный) — посев материала на питатель­ные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одною вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из кон­кретного источника в определенное время, (например, штамм Shigella flexneri №8, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения I клетки (используется при изучении микробных популяций, в гене­тических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами.

В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы — антитела (AT), способные вступать с данным ан­тигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан па выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа (в виде AT или аллергии) свидетельствует о предшествующей встрече с этим микробом: возможно, человек переболел соответствующей ин­фекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Часто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентифи­кация по антигенной структуре).

Микробиологии

Название Микробиологии
страница 1/15
Дата публикации 04.02.2014
Размер 1.68 Mb.
Тип Документы

zadocs.ru > Биология > Документы

ВВЕДЕНИЕ

ПОНЯТИЕ О МИКРОБАХ. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В

Объектом изучения микробиологии являются микроорганизмы — мельчайшие невидимые не вооруженным глазом одноклеточные и многоклеточные существа, которые по многообразию не уступают представителям животного или растительного царства.

— малые размеры (обычно их измеряют в микрометрах — 10″ 6 м, мкм и нанометрах 10″ 9 — нм);

-слабая морфологическая дифференцировка (относительно простое строение);

-быстрый рост и размножение (в благоприятных условиях одна особь за сутки может дать потомство в сотни миллионов особей);

— высокая активность обменных процессов (быстрый синтез и разложение веществ, получение энергии);

-повсеместное распространение (связано с выраженной способностью к адаптации).

Микробиология является комплексом наук.

В зависимости от объекта исследования различают:

бактериологию, вирусологию, микологию (объект — грибы), протозоологию (объект — простейшие).

По целям изучения микробиология делится на:

общую, медицинскую, санитарную, ветеринарную, промышленную,

космическую и др.

^ Задачи медицинской микробиологии:

1. Изучение биологии патогенных (болезнетворных) и нормальных для человека микробов.

2. Изучение роли микробов в возникновении, развитии инфекционных (заразных) болезней и формировании иммунного ответа макроорганизма («хозяина»).

3. Разработка методов микробиологической диагностики, специфического лечения и профилактики инфекционных болезней человека.

Микробы, как наиболее древняя форма жизни, в системе организмов представлены довольно широко. Они входят (наряду с другими организмами) в домен эукариотов, полностью составляют домен прокариотов и царство вирусов.

Прокариоты — это, как правило, одноклеточные организмы, бактерии, отличающиеся слабой морфологической дифференцировкой (доядерные); для них характерно:

— отсутствие окруженногр мембраной ядра (носителем наследственности является нуклеоид замкнутая в кольцо нить ДНК, единственная «бактериальная хромосома»);

— отсутствие органелл (митохондрий, хлоропластов, комплекса Гольджи и др.);

— размножение бинарным делением;

— особое строение и состав клеточной стенки, малые размеры рибосом, своеобразные ферменты белкового синтеза.

Прокариоты разделены на 35 групп: спирохеты, несколько групп собственно бактерий (например, «грамположительные кокки», «спорообразующие грамположительные палочки и кокки», «грамотрицательные аэробные палочки и кокки» и др.), а также риккетсии и хламидии, микобактерии, микоплазмы. В основе деления прокариот на группы лежат: форма и строение клетки, отношение к окраске методом Грама, тип метаболизма и другие признаки. Внутри группы выделены более мелкие таксоны: порядок, семейство, род, вид (основной таксон). Название вида микроба состоит из названия рода и вида. Например, один из возбудителей дизентерии носит название- Shigella zonnei.

Эукариоты Микроскопические — это относительно более высоко организованные одноклеточные и многоклеточные организмы, имеющие сходство с клетками животных (простейшие) и растений (грибы).

Для эукариот характерны:

— наличие истинного ядра, в котором находится набор линейных хромосом, распределяющихся в ходе митоза в дочерние клетки;

— различные органеллы (митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматический ретикулюм и др.);

— рибосомы большего размера, чем у прокариот;

-способность к эндоцитозу (захвату частиц и растворенных веществ).

Вирусы — это мельчайшие неклеточные организмы, которые можно противопоставить всем другим существам. Основные свойства вирусов:

отсутствие клеточного строения;

— отсутствие собственных метаболических систем (у вирусных частиц — вирионов нет обмена с внешней средой);

— облигатный внутриклеточный паразитизм;

— разобщенный способ размножения;

— наследственный материал (геном) представлен одним типом нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК).

^ Методы исследования в микробиологии Различают следующие основные методы: микроскопический, микробиологический,’ экспериментальный, иммунологический, молекулярно-генетический.

1. Микроскопический — изучение морфологии микробов в окрашенном и неокрашенном (нативном) состоянии с помощью различных типов микроскопов. Метод позволяет определить форму, размеры, расположение, структурны элементы и отношение к окраске микробов. Иногда по характерным морфологическим особенностям можно определить вид микроба (грибов, простейших, некоторых бактерий).

2. Микробиологический — (бактериологический, культурный) -посев материала на питательные среды для выделения чистой культуры и определения ее вида (идентификации). Культурой в микробиологии называют совокупность микроорганизмов. Чистая культура — скопление микробов одного вида, выращенных на питательной среде. Штамм — чистая культура, выделенная из конкретного источника в определенное время, (например, штамм №8 Shigella flexneri, выделенный от больного К. 20 сентября). Клон — генетически однородная чистая культура, полученная в результате бесполого размножения одной клетки (используется при изучении микробных популяций, в генетических экспериментах).

3. Экспериментальный (биологический) — заражение микробами лабораторных животных. Метод позволяет:

— выделить чистую культуру микробов, плохо растущих на питательных средах;

— изучить болезнетворные свойства микроба;

— получать иммунобиологические препараты для специфической профилактики, диагностики и лечения.

4. Иммунологический (в диагностике инфекций) — изучение ответных специфических реакций макроорганизма на контакт с микробами. В ответ на поступление микробных частиц (антигенов, АГ) иммунная система организма вырабатывает специфические белковые молекулы антитела (AT), способные вступать с данным антигеном в специфическое взаимодействие с образование комплекса АГ+АТ. Метод основан на выявлении таких комплексов. Выделяют 2 разновидности метода: серологический метод и аллергический метод. Серологический метод основан на выявлении AT в крови или других жидкостях с помощью известных микробных АГ (диагностикумов). Аллергический метод основан на выявлении повышенной чувствительности (аллергии) к повторному поступлению в организм микробного аллергена (АГ). Наличие иммунного ответа свидетельствует о предшествующей встрече с ним микробом: возможно, человек переболел соответствующей инфекцией раньше, был вакцинирован или болен в настоящее время.

Чисто по образованию комплекса АГ+АТ с известными AT определяют вид чистой культуры неизвестного микроба, полученной в ходе исследования микробиологическим методом (идентификация по антигенной структуре).

^ 5. Молекулярно-генетический метод — использование моноклональных антител, и современных методов диагностики основанных на обнаружении нуклеиновой кислоты возбудителя (ДНК или РНК), рецепторов клеток и т.д.
^ МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ МИКРОБОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МОРФОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ.

1Световой микроскоп с иммерсионной системой

Для изучения микробов в микроскопе требуется увеличение примерно в 1000 раз, поэтому используются микроскопы с иммерсионной системой («иммерсио» — погружение). Иммерсионная система включает: иммерсионный объектив (х 90 ) и иммерсионное масло, которым заполняют разрыв между изучаемый предметом и передней линзой иммерсионного объектива. Поскольку показатели преломления стекла и масла близки, это позволяет избежать потери световых лучей вследствие их отклонения, и, тем самым, создать оптимальную освещённость поля зрения. Необходимость в концентрации светового пучка обусловлена также и чрезвычайно малым диаметром передней линзы иммерсионного объектива. При микроскопии необходимо помнить, что объективы «сухой системы» не предназначены для погружения в масло, которое может привести их в негодность. Микроскопия с иммерсионной сиетемой позволяет изучать убитые микробы в окрашенном к (стоянии (их форму, размеры, взаимное расположение, строение бактериальной клетки) и дифференцировать одни микробы от других. Способность микробов окрашиваться различными методами называют тинкториальными свойствами. В некоторых случаях (изучение морфологии грибов, простейших, других относительно крупных объектов в живом неокрашенном состоянии) используется световой микроскоп с затемнённым нолем зрения (объективы х 40 или х 8 ) Для микроскопии готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля». Измерение микробов.Изучение морфологических признаков микробов (длина, ширина, форма) нередко проводят для определения их вида. Размеры клеточных микроорганизмов варьируют от долей микрометра (мкм, 10 -6 м) до нескольких десятков микрометров. Мелкие клетки бактерий имеют размеры 1-2, крупные от 8 до 12 мкм и более. Для измерений используют окуляр-микрометр (встроенную в окуляр прозрачную линейку) и объект микрометр.

2 ^ Темнопольный микроскоп (ультрамикроскоп)

Особенностью этого микроскопа является наличие конденсора темного поля (параболоид-конденсора), который концентрирует световой пучок и направляет его на исследуемый объект сбоку. Ввиду того, что прямые лучи отсекаются центральной диафрагмой конденсора, а косые лучи, выходящие по периферии диафрагмы, не попадают в объектив, ультрамикроскоп еет темное поле зрения. При освещении косыми лучами живых и неживых частиц, в т.ч. микробов, часть отраженных лучей попадает в объектив; при этом наблюдается яркое свечение частиц на темном фоне. Темнопольную микроскопию используют для изучения подвижности микробов, наблюдения очень тонких объектов (спирохет) в препарате «раздавленная капля».

Эта разновидность светового микроскопа позволяет изучать структуру живых неокрашенных микробов (прозрачных объектов). При прохождении света через неокрашенные микробные клетки, в отличии от окрашенных, амплитуда снеговых волн не меняется, а происходит лишь их изменение по фазе, что не улавливается глазом человека. Сдвиг по фазе происходит при прохождении участков с большей оптической плотностью (рибосомы, нуклеоид). Специальные

приспособления: фазовый конденсор и объективы с фазовыми кольцами позволяют преобразовать невидимые фазовые изменения в видимые амплитудные.

Принцип работы этого микроскопа основан на явлении люминесценции. Для получения изображения объектов их обрабатывают флюорохромами, которые при возбуждающем облучении коротковолновой частью спектра светятся цветами с большей длиной волны (зеленым, оранжевым и др.). В люминесцентном микроскопе изучают как живые, так и убитые микробы (с «сухой» или иммерсионной системами). Люминесцентная микроскопия позволяет получить контрастное цветное изображение, обнаружить малое количество микробов, изучить их структуру и химический состав, использовать метод иммунофлюоресценции.

5 ^ Электронный микроскоп

Этот прибор отличается от световых микроскопов значительно большей разрешающей способностью (около 0,001 мкм) за счет использования вместо света пучка электронов, а вместо стеклянных оптических — электромагнитных линз. В электронном микроскопе изучают вирусы, ультраструктуру убитыхх микроорганизмов. Приготовление препарата для микроскопического

I — приготовление мазка.

Предметное стекло обжигают в пламени газовой горелки. Восковым карандашом отмечают пределы будущего мазка в виде окружности диаметром 1-2 см. и кладут стекло на стол. Прокаленной петлёй наносят в середину кружка небольшую каплю стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Затем в эту каплю вносят небольшое количество культуры бактерий, тщательно эмульгируют и распределяют тонким слоем в пределах кружка. Мазки из бульонных культур готовят без предварительного нанесения ИХН.

Стекло оставляют на воздухе до исчезновения влаги.

Фиксацию проводят для того, чтобы убить микробы, прикрепить их к стеклу, повысить их восприимчивость к красителям. Для фиксации предметное стекло (мазком вверх) трижды накладывают на пламя горелки на 2-3 секунды с интервалом 4-6 секунд. Мазки из гноя, крови, мокроты, отечной жидкости фиксируют погружением в фиксирующие жидкости (ацетон,

смесь Никифорова). Такая фиксация позволяет избежать грубых деформаций объекта исследования.

Различают простые и сложные (дифференцирующие) способы окраски. Простые способы позволяют судить о величине, форме, локализации и взаимном расположении клеток. Сложные способы позволяют установить структуру микробов и часто их неодинаковое отношение к красителям. Примером простых способов может служить окраска фуксином (1-2 минуты), метиленовым синим или кристалл-виолетом (3-5 минут), а сложных • окраска по Граму, Романовскому-Гимзе, Циль-Нильсену.

^ Дифференцирующий метод Грама.

После окраски этим методом одни бактерии, окрашиваются в темно-фиолетовый цвет (грамположительные, Гр+), другие — в бордово-красный (грамотрицательные, Гр-). Сущность этого способа окраски состоит в том, что Гр+ бактерии прочно фиксируют комплекс из генцианвиолета и йода, не обесцвечиваясь этанолом. Гр- бактерии после обесцвечивания докрашивают фуксином.

Гр+ бактерии кокки

палочки (спорообразующие): бациллы, клостридии; палочки (неспорообразующие): коринебактерии, микобактерии, актиномицеты

Гр- бактерии кокки

нейссерии, вейллонеллы; палочки (неспорообразующие): энтеробактерии, вибрионы; извитые: спириллы, спирохеты кампилобактерии.

После высушивания мазки готовы для микроскопии.
Основные формы бактерий

^ Структура бактериальной клетки. Обязательные (постоянные) структурные элементы

Обязательными структурными элементами бактерий являются: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка.

Цитоплазма прокариотов в отличие от эукариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в клетке бактерий функцию ядра, т.е. является носителем генетической информации, однако, в отличие от ядра эукариотическоЙ клетки, он не имеет ядерной мембраны, не делится митозом. Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида является единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму и состоит яз тонкого слоя фосфолипидов и белка. Функции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта веществ, участие в биосинтезе веществ, делении клетки. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии.

Клеточная стенка у Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидогликан, который придает клеточной стенке прочность.

Лучшая статья за этот месяц:  Аллерген в хлебе
Добавить комментарий
Шаровидные Палочковидные Извитые
микрококки (одиночные) собственно бактерии спириллы
диплококки (пары) спорообраэующие спирохеты
стрептококки (цепочки) (бациллы, клостридии) кампилобактеры
тетракокки (4 клетки) изогнутые палочки
сарцины (тюки, пакеты) (вибрионы)
стафилококки (гроздья)